Введение к работе
Актуальность проблемы.
В 90-е годы во всем мире, даже в развитых странах, отмечен рост заболеваемости туберкулезом. Раннее выявление и диагностика туберкулеза являются актуальной задачей в борьбе с этим заболеванием.
Основным критерием при постановке диагноза туберкулез остается выделение возбудителя - Mycobacterium tuberculosis. В то же время, на ранних стадиях заболевания культура микобактерий выделяется не более чем у 20% больных, на более поздних - в 50 - 90%, при внелегочном туберкулезе эти цифры значительно ниже - 20 - 50% (Kallenius G., Hoffner S.E. е.а., 1994; Вишневский Б.И., Качанова Н.В., 2000). Методы культурального исследования, как правило, занимают месяцы. Современные варианты с применением жидких сред и автоматизированных систем требуют недель. Быстрый метод бактериоскопии не дает возможности дифференцировать M.tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий и обладает низкой чувствительностью. Таким образом, разработка методов быстрого и специфичного выявления M.tuberculosis представляет собой важную проблему бактериологических лабораторий.
Одной из первоочередных задач бактериологической диагностики туберкулеза является повышение эффективности выделения культур микобактерий и ігх быстрая видовая идентификация. Известно, что помимо типичных клеточных форм, микобактерий могут присутствовать в макроорганизме в виде измененных вариантов, L-форм (Дорожкова И.Р. и др., 1980; Коваленко И.В., 1989). Однако, хотя методы выделения L-форм микобактерий из биологических образцов разработаны уже более двух десятилетий назад, вопрос точной видовой идентификации выделенных L-форм до сих пор остается не решенным окончательно. Для разрешения этой проблемы целесообразно применение молекулярно-генетических методов, позволяющих проводить идентификацию выделенных L-форм на уровне генома.
Для прогнозирования течения заболевания и назначения адекватного лечения необходимо знать основные биологические свойства возбудителя. Особенности биохимических свойств микроорганизмов во многих случаях определяются наличием плазмид, несущих гены, ответственные за сии-
4 тез биологически активных веществ. Многие исследователи сообщали о плазмидах у нетуберкулезных микобактерий (Meissner P.S., Falkinham J.O., 1986; Crawford J.T., Bates J.H., 1988), но четкой взаимосвязи между наличием плазмид и биологическими свойствами установлено не было, и этот предмет все еще требует изучения.
В последнее десятилетие для выявления M.tuberculosis в клинических образцах применяется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако, данные различных зарубежных исследователей об эффективности ПЦР при внелегочном туберкулезе весьма разноречивы (Tortoli Е. et al, 1997; Saltini С, 1998). Актуальной задачей является поиск оптимальных путей подготовки образца для детекции микроорганизмов амплификационными методами.
В структуре детского туберкулеза в России значительное место занимают заболевания, вызываемые вакцинным штаммом BCG. Стандартные методы идентификации M.bovis BCG трудоемки и не всегда точны; более того, диагностика таких заболеваний затруднена из-за низкой высеваемости возбудителя. В этом случае очень полезными могут оказаться чувствительные и специфичные молекулярные методы.
Все перечисленные проблемы обуславливают цели и задачи настоящего исследования.
Цель исследования: Целью настоящего исследования явилась разработка и использование молекулярно-генетических методов для идентификации возбудителей туберкулеза и микобактериозов в клиническом материале.
Задачи работы:
-
Оценить эффективность амплификационных методов выявления микобактерий в нереспираторных клинических образцах и идентифицировать M.bovis BCG непосредственно в биологическом материале.
-
Разработать схему применения молекулярно-генетических методов в диагностике туберкулеза и микобактериозов.
»
-
Идентифицировать L-формы микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции.
-
Определить плазмидный профиль микобактерий и установить взаимосвязь наличия плазмид с биологическими свойствами штаммов.
Научная новизна:
Разработан дифференцированный подход для выявления микобактерий в различных типах клинических образцов методом ПЦР.
Разработана схема применения молекулярно-генетических методов в диагностике заболеваний, вызываемых микобактериями.
Предложен экспресс-метод определения M.bovis BCG в клинических образцах.
С помощью молекулярно-генетических методов доказана микобактериальная природа L-форм, выделяемых из клинических образцов при туберкулезе, и определены особенности структуры ДНК микобактериальных L-форм.
Охарактеризован плазмидный профиль микобактерий, выделенных от больных, проживющих в Северо-Западном регионе Российской Федерации и установлена связь между частотой выделения плазмид и жизнеспособностью микобактерий
Практическая значимость псследования:
Предложенный вариант анализа L-форм микобактерий методом ПЦР позволяет быстро и надежно проводить их видовую идентификацию, что в значительной мере повышает эффективность бактериологической диагностики туберкулеза.
Разработанные варианты выделения ДНК из патологического материала и методы снижения ингибирования ПЦР клиническими образцами позволяют повысить эффективность выявления микобактерий туберкулеза методом ПЦР: - для варианта очистки гель-фильтрацией - на 35%; для варианта с применением сорбента -на 18%; для анализа костей, суставов и тканей - на 25 - 30%.
Выявленная зависимость эффективности ПЦР от типа клинического образца позволила разработать практические рекомендации по выбору исследуемого
материала для обнаружения М.tuberculosis при исследовании биологического материала от больных внелегочным туберкулезом.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Эффективность применения полимеразной цепной реакции для выявления
М.tuberculosis в биологических образцах от больных внелегочным туберкулезом, которая достигнута за счет дифференцированного подхода к выделению ДНК из различных типов проб, превосходит эффективность стандартных бактериологических методов (микроскопии и посева) в 2 - 20 раз. Предложенная схема применения молекулярно-генетических тестов позволяет проводить ускоренную идентификацию и исследование биологических свойств микобактерий различных видов.
2. L-формы, выделяемые из биологических образцов от больных внелегочным
туберкулезом и идентифицированные методом полимеразной цепной реакции в 85% случаев принадлежат к М.tuberculosis и к M.bovis BCG, при этом ДНК культур L-форм не всегда содержит инсерционный элемент IS 6110.
3. Нетуберкулезные микобактерий - возбудители микобактериозов,
выделяемые от больных, проживающих в Северо-Западном регионе РФ, содержат плазмиды: M.avium - 28% щтаммов, M.chelonae - 37,5% и M.fortuitum - 49%. Наличие плазмид взаимосвязано с биологической активностью микобактерий.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на: СПб научном обществе микробиологов (1997, 1998, 1999, 2000), Европейском ежегодном семинаре ми-кобактериологов (Париж, 1996), русско-финском совещании по проблеме инфекционных заболеваний (Турку, 1997, Хельсинки, 1998, СПб, 1999), русско-финском семинаре по проблемам туберкулеза (СПб, 1998, 1999), Научно-практической конфе-ренции СПбНИИФ (1997, 1998), Всероссийском съезде микробиологов и эпидемиологов (Москва, 1998), пленуме Межведомственного
,
7 научного совета РАМН и N43 РФ по туберкулезу и гранулематозным заболеваниям легких (Москва, 1998), Всероссийской научно-практической конференции "ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний" (СПб, 1998), международном семинаре по проблеме изучения полирезистентных микобактерий туберкулеза (СПб, 1999), международной конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 2000), региональной научно-практической конференции "Роль хирургических методов в лечении внелегочного туберкулеза" (СПб, 2000).
Диссертационное исследование выполнено по плану научно-исследовательских работ СПбНИИ фтизиопульмонологии и апробировано на заседании коллектива Проблемной комиссии №4 СПбНИИФ "Экспериментально-лабораторные исследования во фтизиатрии и пульмонологии".
Внедрение в практику.
Материалы исследования использованы при подготовке Методических рекомендаций "Методы выделения ДНК для диагностики внелегочного туберкулеза путем полимеразной цепной реакции" и "Повышение эффективности этиологической диагностики внелегочного туберкулеза".
Результаты работы внедрены в клинико-лабораторную практику бактериологической лаборатории и используются в клиниках внелегочного туберкулеза Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии.
Публикации результатов исследования.
По теме диссертации опубликовано 23 печатных работы и 2 находятся в печати. Утверждены Минздравом России Методические рекомендации "Методы выделения ДНК для диагностики внелегочного туберкулеза путем полимеразной цепной реакции" (№ 99/154, 1999 г.).Получена приоритетная справка по заявке на изобретение «Способ бактериологической диагностики туберкулеза» (№ 2000103371 от 10.02.2000 г.).
Структура и объем диссертации.