Введение к работе
Актуалъйость проблемы. Вопросы изучения контаминации медицин-ких иммунобиологических препаратов (МИШ) агентами различной привода до настоящего времени остаются одной чіз актуальных проблем ри оценке качестза биологических препаратов, выпускаемых медицин-кой промышленностью. Среди контамшшрувдих агентов особое место анимагат микоплазш, источником которых могут быть ткани и органы іоноров, используемые для приготовления клеточных субстратов, іелковне компоненты питательных сред, а также персонал, занимага-іийся изготовлением препаратов.
В настоящее время при изготовлении и контроле МИБП исполь-
уется около 20 различных первичных и перевиваемых клеточных
уль'-ур. Широкое использование клеточных культур при производст-
)б и контроле вирусных вакцин, а также в научных исследованиях
[редъявляет к ним ряд определенных требований. Одним из требова-
шй ВОЗ является недопустимость микробной, вирусной и микоплаз-
їєішой контаминации. Последняя инфекция чаще всего носит скрытый,
[атентный характер, но иногда влияет на структуру и функции клеток-,
[рисутстше микоплаэм в клеточных культурах может приводить к иа-
іенению роста клеток, их пролиферативной активности и индукции
морфологических изменений (Каган Г.Я., Раковская И.В., 1968;
Barile U., 1981j Mo Garrit'y G., 1979 и др.), к ингибиции'или сти-
дуляции трансформаций лшлфоцигов (Barile И., 1973; Coll В., 1982;
і др.), к изменению синтеза углеводов, аминокислот, РНК и ДНК,
ЭНЗИМНОГО состава клеток ( Barile Ы., 1968, 1975, 1981; Мс Garri-
ty G. И Др., 1978; St'anbridge Е. И др., 1978; fc-'-anbrldge Е.,
[981), индукции хромосомных аберраций (Barile Ы., 1981; Nichols sv.,
197»), '
Известно, что первичные культура и диплоидные штаммы клеток
юнтаминироваш микоплазмами незначительно - 1-4 % (Раковская И.В.,
Зульйовиї Ю.В., 1990; Barile М., 1981). " '
В клеточных культурах взаимодействие вирусов и микоплазм зависит от вида клеток, природы вирусов и микоплазм. Показано інгибиторное действие микоплаэм на гемагглютширующую активность ї репродукцию ряда вирусов (Раковская И.В., Вульфович Ю.В., 1990; Gray J., 1982 ). Доказано как стимулирующее, так и ингибирую-цее действие микоплазм на продукцию интерферона (Раковская И.В., Зулъфович Ю.В., 1990; Смирнова Т.Д., Каган Г.Я., 1971; Вагіїе її.,' 1979). Ряд исследователей приходит к виводу, что оди'л.'. из оопс.ііих
источников загрязнения клеточных линий мякоплазмаш является сыворотка животных - один из компонентов питательных сред для культивирования вирусов в клеточных культурах (Каган Г.Я., Раковская И.В. 1968; Икоев В.Н., 1972; Раковская И.В,, Вульфович, Ю.В., 1990; Barile М., и др., 1962; Базсіїе М., 1975)- 3 пользу этого свидетельствует широкое инфицирование крупного рогатого скота различными видами микоплазм, сопровождающееся продолжительной циркуляцией возбудителя в крови животных (Коромнслов Г.Ф., Месарош Я., 1987; Doig Р.А., 1981s Gars D.N. . 'и др., 1988; Stipkovits Ь. и др., 1983; Jasper D. , 1987; Jaeper D. и ДР., 1987; *aoudi А. и др., 1985; Foumarat Г. и др., 1987; Tanskanen в., 1987,1988; Trichard О. и др., 1985).
Из вышеизложенного ясно, что контроль сыворотки крови, используемой при культивировании клеток на наличие микоплазм, является необходимым и обязательным.
, \ В производственных условиях при изготовлении вирусных препаратов при контроле их стерильности от микоплазменной инфекции требуются высокочувствительные и доступные метода. Увеличение доступности, чувствительности, экономичности и быстроты получения результатов позволяют в конечном счете выпускать препараты, отвечающие более высоким требованиям стерильности и показателям качества.
В действующей в настоящее вреда НГД единственным критерием оценки качества сыворотки крупного рогатого окота являются физико-химические показатели и отсутствие микробной контаминации. Современные методы выявления микоплазм, предлагсшмые ВОЗ и фирмами, производящими препараты, основаны толысо на микробиологическом методе с использованием искусственных питательных сред в разной модификации.
цель исследования. Целью настоящего исследования явилась унификация и стандартизация методов обнаружения микоплазменной контаминации МИБП и коммерческих сывороток крови различных животных, используемых для приготовления клеточных культур, предназначенных для производства и контроля МИШ. На основании разработанных методов изучение уровня контаминации выпускаемых в стране препаратов.
Для достижения указанных целей ставились следующие задачи;
I. Дать сравнительную оценку качества питательных сред, ис
пользуемых для культивирования микоплазм и их стандартизация на
основе количественных показателей и воспроизводимости роста мико
плазм.
-
Разработать и изучить в соответствии с требованиями ВОЗ раслевой сталдартный образец (0С0) тест-штамма микоплазм с целью пользования его для оценки качества различных серий питательных івд, получаемых в учреждениях страны. L
-
Разработать чувствительный метод выявления минимального їличе'ства микоплазм на искусственных питательных средах.
-
Разработать цитохимический метод выявления микоплазм-конта-інантов сыворотки крупного рогатого скота.
Ндучная новизна
Впервые научно обоснована необходимость совершенствования стандартизации методов контроля МИБ1І на отсутствие миконлазмон->й контаминации.
Определены оптимальные условия, способствующие выявлению шималыюго количества микоплазм в сыворотках животных.
Дана оценка качества сланных по составу искусственных пита— шпьое сред, иопользуамых для выявления микоплазм.
Впервые показана возможность применения клеточных культур [Я обнаружения цитохимичоским методом микоплазм в сыворотко крови >ушюго рогатого скота.
- Впервые в стране получен отраслевой стандартный образец ют-штамма Mycoplasma ai-,iirii ni gj^o для опредолешш чуистви-зльности искусственной питательной среды для выявления микоплазм оценки ее стандартности.
При выполнении отих исследований получены результаты, позво-
ші(ио сделать ряд научных обобщений:
- Данные по изучению уровня контаминации сыворо'/..и различ
ие животных, позволили теоретически обосновать и эксперименталь—
э апробировать чувствительный метод выявления минимальных- коли-
зсгв'микоплазм при изучении уровня контаминации сывороток живот-
п, различающихся как по принадлежности к видам животных, так и
з способу приготовления коммерческого препарата. '
Сравнительное изучение информативности различных методов іяоления микоплазм в сыворотках животных позволило обосновать зобходимость применения при выпуске коммерческих препарате!) сы-зротки крупного рогатого скота, используемой для выращивания гбетратов МИБЛ, двух методов - микробиологического и цитохиш-зского.
Экспериментально обоснована необходимость использования
тест-штамма Иусорішия srginioi G230 для опредвлешія качесті и стандартизации питательных сред, применяемых для выявления мшюплазм-контамяиантав МИШ.
Практическая ценность и реализация результатов исследоваі в практике здравоохранения.
Разработана схема контроля сыворотки крови животных на контаминацию микоялазыаш, которая отличается чувствительноеи простотой постановка экспериментов, воспроизводимостью резуль: тов. На основании яроведеиннх исследований разработаны и внед] ны в практику здравоохранения методические указания: "Контрол: сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирусов-конташнантов и микоплазм", М., 1988, утвержденные Минздравом (РД 42-28-14-88). Методика вводится в НТД на различные препар требующие проведения контроля на наличие микоплазм, что позво. повысить качество проводимого исследования.
Для определения чувствительности искусственной питател среды разработан отраслевой стандартный образец тест-штамма plasma arginini G2J0 (ОСО 42-28-105-87). На ОСО составлены Свидетельство и Инструкция по применению. Препарат использует практическими учреждениями при приготовлении каждой новой сер питательной среды для оценки ее качества.
Основные положения, выносимые на :задмту
-
Результаты изучения качества питательных сред для кул вирования микоплазм на основа количественных показателей и во производимости роста микоплазм в средах, различных по составу
-
Получение и изучение стандартного образца тест-штамма Mycoplasma arginini G230 для определения пригодности питате rsx. сред для контроля ВДБП на отсутствие микоплазм-коятаминан
-
Итоги изучения выделения микоплазм из сыворотки крови различных животных на искусственных питательных средах в разл ных модификациях.
-
Возможность использования цитохимического метода вняе микоплазм-контаминантов сыворотки крови крупного рогатого скс
-
Данные многолетних наблюдений по выявлению микоплазм-таминантов в МИБІЇ, поступающие в ГИСК в порядке Госнадзора.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 7 работ.
_ 5 -
Апробация работы. Основные положения и виводи диссертацион-й работы били долонены и обсуждены на объединенном заседании облемных комиссий Научного Совета по мияробиологяи АМН СССР "Мединская микробиология" и "Теоретическая прикладная иммунология" вместно с секцией микробиологии ВНОМЭИ им. И.И.Мечникова (29 ап-ля 1989 г.) и на заседании Ученого Совета ГИСК им. Л.А.Тарасеви-(28 мая 1991 г.) и рекомендована к завійте.
Структура и объем работы. Работа изложена на 136 страницах лганописного текста, содержит 15 таблиц и 10 рисунков. Список ли-ратуры включает 190 источников, из которых 45 отечественных и 5 иностранных авторов.