Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Разработка методов ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации Clostridium botulinum типов А и В Шлепникова, Оксана Валерьевна

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Шлепникова, Оксана Валерьевна. Разработка методов ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации Clostridium botulinum типов А и В : автореферат дис. ... кандидата биологических наук : 03.00.07.- Москва, 1995.- 21 с.: ил.

Введение к работе

Актуалми>ег*лро$яе*4ьи

Ботулизм тяжелое заболевание человека и животных нервно-паралитического характера, часто имеющее летальный исход. 8 1992 г. в России иареімсірироваие» fw>"ee 400 егг/гйспГ даїшогй оабшіевания.

Clostridium botulinum, анаэробные спорообразующие

микроорганизмы, продуцируют нейротоксины, являющиеся самыми сильными токсинами природного происхождения. В среднем, летальная доза для мышей составляет Ю пг ботулинического нейротоксина [ SakagucM G.,1983]. В настоящее время известно 7 серологически различных типов иейротоксинов: А, В, С. D, Е. F и G. Все они продуцируются различными штаммами С. botulinum, но имеют сходные размеры и молекулярную организацию. Это достаточно бопьшие белки, состоящие из 2 полипептидных цепей - легкой (50-59 xDa) и тяжелой (85-105 кОа). соединенных между собой как минимум одной дисульфидной связью t Smith LO.,1977 ]. Іюпадая в организм человека или животных, ботулинические нейротоксины действуют на уровне периферической нераной системы, где блокируют выделение медиатора - ацегилхолина [Sctlin L.C., 1981). Несмотря на то, что заболевание ботулизмом известно уже более 200 лет, в настоящее время детальный механизм действия нейротоксинов «едостаточмо изучен, в особенности на молекулярном уровне. Считается, что нейропаралитический эффект токсина достигается в результате прохождения им 3 стадий: связывания токсичной молекулы на поверхности пресинаптической мембраны, энергозависимого

проникновения части молекулы внутрь клетки и ингибирующей стадии ( Simpson L.L,1981].

Лекарств против ботулизма сейчас не существует. Полагают, что ботулизм человека вызывается 4 типами нейротоксинов А, В, Е и F. Кроме классических штаммов С. botulinum, как. было обнаружено, причиной ботулизма могут являться некоторые другие микроорганизмы, как, например, С. butyricum, продуцирующий иейротоксин типа Е [McCroskay LM.,1986], и С. barati, продуцирующий иейротоксин типа F I Hall J.D., 1985]. Сравнительно недавно были расшифрованы нуклеотидные последовательности генов нейротоксинов типов А [ Binz Т., 1990, Thompson D.E.,1990], В [ Whelan S.M.,1992], С [Hauser D..1990], D [ Binz T.,1990], E [Whelan S.M.,1992]. F {Thompson D.E., 1993].

Что касается диагностики ботулизма, то она имеет целый ряд проблем. Это, во-первых, связано со сложностью культивирования клостридий как анаэробов и отсутствием селективных сред для них. Кроме того,- единственным методом, позволяющим с высокой чувствительностью идентифицировать ботулинические нейротоксины, является биопроба на мышах в сочетании с реакцией нейтрализации специфическими антитоксинами. Данный метод требует большого количества лабораторных животных, использование которых в настоящее время принято считать не этичным. Помимо этого, биопроба также не всегда обеспечивает получение необходимой информации. По статистическим данным, 65% клинических случаев ботулизма не имеют лабораторного подтверждения. Разработанные на настоящее время иммунологические методы определения нейротоксинов не нашл*

широкого применения ввиду недостаточной чувствительности [ Oguma К.. 1980, Oguma К., 1984).

В последние годы для выявления целого ряда патогенных бактерий разработаны методы, основанные на использовании ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции, которые достаточно хорошо зарекомендовали себя в практике.

В связи со сказанным выше становится очевидной iir>r>fi*nrn»«

Цели»_и_аадачи... иседедован иіи

Целью настоящей работы являлась разработка молекулярно-биологических методов для идентификации С. botulinum. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) Получение зонда для гибридизации, специфичного для гена нейротоксина С. botulinum типа А.

  1. Разработка метода ДНК-гибридизации для выявления С. botulinum А.

  2. Разработка метода ПЦР для идентификации С. botulinum типа А.

  3. Разработка метода ПЦР для идентификации С. botulinum типа В.

  4. Оценка возможности использования методов ДНК-гибридизации и ПЦР для тестирования биологических проб.

Наїаиая^ои*зшЦиицаи>імес.кая^еішша,і.^абш*и.

В данной работе показана возможность использования ДНК-зондов для идентификации Clostridium botulinum типа А. Методом гибридизации по Саузерну впервые было выявлено наличие 2 групп штаммов С.

bolulinum А, различающихся по областям ДНК, расположенным перед геном нейротоксина. Эти данные могут быть, в частности, использованы при исследовании%лидемиологии ботулизма.

В последние годы зарубежными учеными предприняты попытки адаптировать метод ПЦР для выявления С. bolulinum [ Szabo Е.А.,1992, 1993]. В России подобные исследования проводятся впервые. Разработан метод ПЦР для идентификации С. bolulinum типов А и В, обладающий высокой специфичностью и чувствительностью (1 пг ДНК), который может быть использован в диагностических лабораториях для выявления данных микроорганизмов. Метод ПЦР прост в исполнении, обеспечивает быстроту получения результатов (5 часов от начала исследования) и особенно удобен в тех случаях, когда необходимо протестировать большое число проб. Полученные данные поданы в ГИСК им. Тарасевича для составления Временной фармакопейной статьи.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Метод ДНК-гибридизации для идентификации Clostridium
botulinum типа А. .

  1. Штаммы С. botulinum типа А можно разделить на группы при помощи гибридизации по Саузерну, используя полученный зонд.

  2. Метод полимеразной цепной реакции для выявления С. botulinum типов А и В.

Апробация диссертационной работы проведена на научной конференции лаборатории клостридиозов 19 января 1995 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 печатная работа.

0бьемл„сіруктура_лиссеріаиии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 разделов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и 14>шюс1риг>«эн!! Т7 "p"C/"Kui.:u vi о іабіїицами. (;nwro< питерятури содержит 133 наименования.