Введение к работе
Актуальность тема. Лептоспирозы относятся к группе природ-ноочаговнх зоонозов, имеющих иирокое распространение в различных климато-географических и ландиафтннх условиях. С начала 00-х годов и до настоящего времени во многих странах отмечается устойчивая тенденция роста заболеваемости этими инфекциями среди людей, проявляющейся как в виде спорадических случаев, так и крупных эпидемических вспняек ( Ю.М. Федоров S В.В. Гораенко, 1990; Shi М.Н.. 1995 и др.). Однако наиболее интенсивные природные очаги этих инфекций, имеющие выраженное эпидемическое проявление. расположены в странах тропического пояса (J.D. Everard Я, C.O.R. Everard, 1993 и др.). С момента введения официальной регистрации лептоспирозов в 1955 году эта проблема остается в числе приоритетных в системе национального здравоохранения Китая. В его южных и юго-восточных провинциях ежегодно регистрируются десятки, а в отдельные годы более ста тысяч случаев заболеваний среди людей при показателях летальности, достигающих І07. ( Shi И.П.. 1995). Столь высокий процент неблагоприятных исходов в значительной мере обусловлен несвоевременной диагностикой, которая осложняется следующими моментами:
-
Многообразием спектра клинических проявлений болезни: от гепаторенального синдрома до геморрагических пневмоний.
-
Своеобразием и сложностью этиологической структуры лептоспирозов в Китае, где установлена циркуляция патогенных лептоспир, относящихся к 74-м сероварам 19 серогрупп (Shi Н.Н., 1995: Luo Y.B. 1992.)
-
Отсутствием эффективных средств ранней лабораторной
- 2 -диагностики лептоспирозной инфекций адекватных региональным особенностям этиологической структуры.
Вполне очевидно, что при столь разнообразном серопейзаке возбудителей использование " золотого стандарта " лабораторной диагностики лептоспирозов - реакции микроагглютинации лептоспир (РИА) представляет определенные трудности из - за необходимости использования широких панелей диагностических штаммов всех эпидемически значимых для данной территории серогрупп. Кроме того, специфические агглютинины, как правило, выявляется не ранее конца 1-й, начала 2-й педели заболевания. В этой связи возникает необходимость в разработке новых методов ранней лабораторной диагностики лептоспирозов, которые могут быть использованы в очагах со слоїной этиологической структурой, в частности, в очагах тропического пояса Китая.
В этом отношении представляется перспективным использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанного на амплификации специфических последовательностей ДНК и отличающегося высокой чувствительность» и специфичностью.
Ранее разработанные за рубежом высокочувствительные тест-системы на основе ПЦР для индикации лептоспир ( Uan Ejs,1989; Eravekaap, 1990; Perolat,1993) обладает родовой, либо серогрупповой специфичностью. Видоспецифичная ПЦР тест-система с использованием С - праймеров ( Й.П.Самсонова и др., із!)4 г.> такме не отвечает указанным задачам, поскольку не позволяет виявлять ДНК лептоспир ряда серогрупп и преаде 'всего Grippotyphosa - одной из наиболее распространенных и эпидемически значимых во многих странах мира, включая Китай. Кроме того, до настоящего времени не проводилось исследований по оценке диагностической эффективности ПЦР-анализа в сравнении с тради-
- З -пионннми методами лабораторной диагностики в очагах лептоспиро-зов с различной этиологической структурой и на разных стадиях заболевания.
Цель исследования. В связи с изложенным целью исследований явилась разработка внсокочнвствительной и видоспецифичной тест-системы на основе ПЦР для диагностики лептоспирозов в условиях политипичных очагов тропического пояса, а также оценка г.г диагностической эффективности в сравнении с иммунологическими методами.
Основные задачи исследования. 1) На основании данных литературы провести анализ этиологической структуры лептоспирозов в различных провинциях Китая; определить наиболее значимые в эпидемическом отношении серовары возбудителей.
-
Провести идентификацию «таммов лептоспир. выделенных от больных лептоспирозами в Китае, в реакции микроагглютинации (PMfl) с панелями моноклональннх антител.
-
Подобрать праймерн и оптимальные условия постановки ПЦР. обеспечивающие таксономическую специфичность тест-системы.
4) Определить чувствительность разработанной ПЦР-тест-
системн на препаратах очинённой ДНК и лизатах клеток чистых
культур L. interrogans, а также на модельных образцах
клинического материала.
5)Дать оценку диагностической эффективности разработанной ПЦР тест-системы на различных стадиях заболевания лептоспирозом в сравнении с традиционными иммунологическими методами (РМА и слайд-агглютинации (БАСА)).
Научная новизна. На основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) разработаны две высокочувствительные тест-системы (G- и
- 4 -B-) для индикации патогенных лептоспир (Leptospira interrogans), в том числе возбудителей, имеюцих наибольшее эпидемическое проявление в политипичных очагах лептоспирозов тропической зони Китая. При постановке ПЦР со смесью праймеров отмечено явление их интерференции. С поыоцью панелей ыоноклональных антител среди штаммов серовара grippotyphosa, выделенных от больных в провинции Сычуань, идентифицировано два новых субсе-ровара, которые такає различались между собой по температурному спектру реакции в ~ и (Є+В)-тест-системах ПЦР. Впервые проведены испытания диагностической эффективности ПЦР-анализа в очагах лептоспирозов с различной этиологической структурой в зависимости от стадии заболевания.
Практическая значимость работы. Показана возможность использования разработанных Є- и В-тест-систем ПЦР в целях ранней диагностики лептоспирозов (начиная с 1-го дня заболевания) в политипичных очагах лептоспирозов. Получены данные, свидетельствующие о перспективности использования ПЦР-анализа для контроля течения инфекции и прогноза возможных осложнении лептоспирозов. Результаты работы используются при чтении лекции для врачей бактериологов и эпидемиологов в Информационном Центре Госсанэпидназора РФ и Российской Медицинской Академии последипломного обучения.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на научно-практической конференции " Биомедицинские технологии" РАМН, Московской медицинской академии и РУДН (февраль, 1996 г.) и на совместной конференции отдела инфекций с природной очаговостью и лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИЭМ им.11.Ф.Гамалеи РАМН (апрель 1996 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы і тези-
- 5 -сн. 2 статьи сданы в печать.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения , 6 глав, заключения, выводов и списка литературы, вклю-чашцего 150 работ ( из них на русском языке - 32. на иностранных языках - 118). Работа изложена на 105 страницах машинописи, иллюстрирована 20 таблицами и 11 рисунками.