Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Структура микробиоценоза ризосферы и ризопланы культурных растений
1.2. Свойства ризобактерий, оказывающих положительное влияние на растение
1.2.1. Адгезивные свойства ризосферных бактерий 21
1.2.2. Продукция ризосферными бактериями гормонов роста 23
1.2.3. Антагонистическая активность ризобактерий 28
1.3. Биологические свойства и современные методы идентификации 32
бактерий вида Вacillus subtilis
ГЛАВА 2. Материалы методы исследования 38
2.1. Объекты исследования 38
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Бактериологические методы изучения микрофлоры ризосферы и 43 ризопланы растений 2.2.2. Видовая идентификация В. subtilis методом газожидкостной хроматографии
2.2.3. Атомно-силовая микроскопия в изучении морфофункциональной стабильности ризобактерий .
2.2.4. Молекулярно-генетический метод 49
2.2.5. Определение фитогормонов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
2.2.6. Метод определения антагонизма В. subtilis к фитопатогенам 2.3. Методы статистического анализа данных 54
ГЛАВА 3. Микробиоценоз корневой зоны cucurbita Pepo L 55
3.1. Структура микробиоценоза ризосферы C. pepo в процессе вегетации 56
3.2. Микробиоценоз ризопланы C. pepo в различные стадии вегетации .. 62
3.3. Характеристика биологических свойств и идентификация бактерий ризосферы и ризопланы 69
3.3.1. Морфологические и культурально - биохимические свойства выделенной микрофлоры 69
3.3.2. Биологические свойства и результаты ГЖХ-идентификации з
бактерий рода Bacillus 81
ГЛАВА 4. Морфометрические и упруго-механические свойства ризосферных бактерий 92
4.1. Результаты АСМ-визуализации B.subtilis 92
4.1.1. Морфометрические и упруго-механические свойства B.subtilis, выделенных в различные стадии вегетации C. pepo 92
4.1.2. Изменение морфологических и упруго-механических свойств в фазы роста B. subtilis 97
ГЛАВА 5. Характеристика свойств ризобактерий b. subtilis, оказывающих положительное влияние на растение 104
5.1. Выявление генов, детерминирующих адгезию ризосферных бактерий B. subtilis 104
5.1.1. Подбор праймеров для выявления генов tap A и eps A B. subtilis 104
5.1.2. Разработка протокола проведения амплификации 106
5.1.3. Результаты детекции нуклеотидных последовательностей генов tap A и eps A B. subtilis 108
5.1.4. Определение частоты встречаемости генов адгезии tap A и eps A у штаммов B. subtilis, выделенных в различные периоды вегетации С. pepo L 109
5.1.5. Результаты количественной оценки фрагментов генов tap A и eps A 111
5.2. Определение ростостимулирующей активности ризосферных штаммов B. subtilis 116
5.2.1. Синтез фитогормонов гибберелловой и абсцизовой кислот ризобактериями B. subtilis 116
5.2.2. Ростостимулирующее влияние B. subtilis на рост проростков, развитие растений и урожайность C. pepo L 124
5.3. Оценка антагонистических свойств бактерий B. subtilis 128
Обсуждение результатов 135
Выводы 150
Практические рекомендации 151
Список литературы 1
- Продукция ризосферными бактериями гормонов роста
- Атомно-силовая микроскопия в изучении морфофункциональной стабильности ризобактерий
- Микробиоценоз ризопланы C. pepo в различные стадии вегетации
- Морфометрические и упруго-механические свойства B.subtilis, выделенных в различные стадии вегетации C. pepo
Продукция ризосферными бактериями гормонов роста
Растения, как и другие организмы, существуют в природе в виде многоорганизменных сообществ, что достигается обильной колонизацией макроорганизма – хозяина грибами и бактериями. Известно, что жизнедеятельность и продуктивность растений во многом зависят от того, какие микробы и в каком количестве колонизируют поверхность и внутренние компартменты растения (Антонюк, 2010). Почва, прилегающая к корням, является зоной прямого влияния растений; обитающие в ней микроорганизмы формируют на корнях растений сложные по структурно-функциональной организации и таксономическому составу сообщества. Онтогенез растений происходит при их тесном взаимодействии с микроорганизмами почвы, которые заселяют ризосферу и образуют ассоциацию: «микроорганизмы — корневая система растения» (Курдыш, 2010).
Растение, стимулируя размножение микроорганизмов около своих корней, обеспечивает себе мощный дополнительный фактор воздействия на почву, в результате чего образуются доступные питательные вещества, накапливаются различные физиологически активные и стимулирующие вещества, что улучшает условия питания растений (Феоктистова, 2016).
Сами растения и продуцируемые ими вещества являются источниками питания для микроорганизмов. Средой обитания микроорганизмов служат поверхностные и внутренние структуры растения, которые представляют собой пространство для роста, перемещения и распространения вместе с частями растения.
Развивающаяся корневая система прорастающего семени, проникая вглубь почвы, вступает во взаимодействие с почвенными микроорганизмами, животными и корнями других растений. Известно, что вокруг корня формируется ризосфера – окружающая корень почва, характеризующаяся высокой плотностью микроорганизмов. Размер ризосферы исчисляется примерно от 0 до 8 мм в диаметре, количество микробных клеток в ней может превышать их число в окружающей почве в сотни раз (Bais, 2006; Бегжанова, 2013).
Ризосфера является областью интенсивной микробной активности, управляемой корневыми экссудатами. Ризосфера формируется, когда молодой корень появляется в определённой почвенной ячейке и отмирает вместе с отмиранием корня, видоизменяясь и осуществляя разложение корневых остатков (Алесина, 2010).
Число микроорганизмов в ризосфере в 100 раз больше, чем в почве, где растения не произрастают, что связано с выделением корнями растений различных питательных веществ (Емцев, 2005).
Кроме того, бактерии плотно заселяют поверхность корней, формируя сообщество ризопланы. Показано, что они находятся на расстоянии 0,03 мм от поверхности корней. Чтобы взаимодействовать с корнем, микроорганизмы должны располагаться на расстоянии диффузии экссудатов (Иутинская, 2010). Ризосфера растений является тем местом, где происходят сложные и многообразные растительно-бактериальные взаимодействия (Чеботарь, 2007). Среди микроорганизмов, которые преобладают в ризосфере и из которых могут состоять бактериальные комплексы микрофлоры ризосферы различных растений, насчитывается около 66 видов (Бухарин и др., 2007). Наиболее часто микробные сообщества корневой зоны растений представлены такими микроорганизмами, как Pseudomonas, Bacillus, Bacterium, Chromobacterium, Mycobacterium, Mycococcus, Micrococcus, Pseudobacterium, Sarcina, Promyxobacterium, Azotomonas, Lactobacterium (Surette, 2003; Sandhiya, 2005; Rosenblueth, 2006; Lugtenberg; 2009; Sgroy, 2009; Stajkovic, 2009; Liu, 2012).
Один и тот же вид микроорганизма может быть обнаружен на корнях различных растений. Так, например, Pseudomonas fluorescens обнаруживают на корнях овса, пшеницы, кукурузы, гречихи, подсолнечника, вишни, яблони, сливы, крыжовника, Perissoneura chrysea - на корнях овса, пшеницы, гречихи, яблони, сливы, вишни, Bacterium agile - на корнях овса, кукурузы, гречихи, огурцов, яблони, крыжовника, Мусobacterium album - на корнях пшеницы, кукурузы, свеклы, табака, вишни, сливы, Мусobacterium rubrum - на корнях пшеницы, кукурузы, яблони, вишни и др. (Возняковская, 1980; Леонтьевская, 2014; Снисаренко, 2014; Ерина, 2015).
В то же время рядом исследований показано, что качественный и количественный состав микрофлоры ризосферы специфичен для каждого вида растений (Бороздина, 2011). В настоящее время изучена корневая микрофлора злаковых (пшеницы, ржи, овса, ячменя), трав (ежи, райграса и пр.), бобовых (фасоли, гороха, вики, клевера, люцерны и др.), культур, представляющих пищевую ценность (огурцы, томат, картофель, свекла), технических культур (хлопчатника, табака, льна, конопли и др.) и древесных пород плодовых и декоративных растений (акации, тополя, липы, дуба, яблонь, слив, груш и др. (Кравченко, 2002; Forchetti, 2007; Гажеева, 2011; Гордеева, 2012; Сорокалетова, 2012).
Зерновые и бобовые культуры обладают пищевой ценностью и являются основой севооборотов большинства регионов умеренного пояса. Поэтому микрофлора прикорневых зон данных культур является наиболее изученной.
В исследовании Звягинцева показано, что в микробный состав ризосферы гороха входят такие микромицеты, как Aspergillus jumigams, Actinomucor elegans, Fusarium aquaeductuum, F. nivale, F. oxysporum, F. solani, F. sporotrichbides, Humicota grisea, Mycogone nigra , Mucor circineibides, Penicillium canescens, P. chrysogenum, P. decumbens, P. frequentans, P. funicubsum, P. herquei , P. kapuscinskii , P. lanoso-coetuleum, P. nalgiovenses, Trichoderma hamatum, T. polysporum (Звягинцев, 2005).
Атомно-силовая микроскопия в изучении морфофункциональной стабильности ризобактерий
Метод отбора проб ризосферы и ризопланы растений Исследуемые образцы ризосферы отбирали при помощи устройства для забора и транспортировки образцов, содержащих микроорганизмы (Патент № 153399 от 22.06.2015 г.), которое обеспечивало одинаковый объем отбираемых образцов и исключало контаминацию при транспортировке. С помощью указанного устойства отбирали пробы ризосферы массой 5 г. Затем полученные образцы помещали в колбы со 100 мл стерильного физиологического раствора и взбалтывали в течение 2 мин. После этого из колбы стерильной пипеткой брали по капле суспензии и высевали на поверхность питательной среды в чашке Петри. Чашки инкубировали в термостате при 370С в течение 48 часов.
Необходимым этапом подготовительных работ к микробиологическому анализу образцов ризопланы являлась десорбция микроорганизмов с поверхности корней.
Выделение бактерий ризопланы тыквы обыкновенной осуществляли по методу последовательных отмываний корней (Теппер, 2004). Для этого в пробирке с физиологическим раствором размачивали прилипшие к корням частицы почвы, затем 3 раза переносили в пробирки со стерильным физиологическим раствором и 4 раза промывали в стерильной воде. Очищенные таким образом корни измельчали стерильным пинцетом и ножницами, после чего помещали в стерильную чашку Петри. Затем отбирали навеску корней массой 5 г и растирали их в стерильной фарфоровой ступке. Измельчённые корни смывали в колбу с таким расчётом, чтобы объем полученной супензии составил 50 мл. В колбу добавляли 5 г кварцевого песка и встряхивали супензию в течение 5 минут. Затем 5 мл жидкости переносили в другую колбу, содержащую 45 мл стерильной воды. Из первой колбы 5 мл супензии добавляли во вторую колбу с 45 мл воды, из третьей-в четвёртую. Таким образом готовили 7 разведений, которые в соответствии с диагностической системой ризосферных бактерий СВИРБ (система выделения и идентификации ризосферных бактерий – рационализаторское предложение №5 от 16.09.2015 г.) высевали на поверхность плотных питательных сред. Чашки Петри с посевами культивировали в термостате в течение 48 часов при температуре 370С. Далее производили идентификацию выделенных культур.
Родовую и видовую идентификацию ризобактерий осуществляли по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и антигенным свойствам с помощью Определителя бактерий Берджи (2013) и программного обеспечения для автоматизированной идентификации бактерий производства «НПО Диагностические системы» (Россия). Морфологические и тинкториальные свойства выделенных штаммов микроорганизмов изучали с помощью биологического микроскопа со встроенной цифровой камерой DMB-200 (Россия, общее увеличение-15х100).
Для изучения ферментативной активности изолятов были использованы диагностические системы, которые позволили выявить способность бактерий к утилизации малоната натрия, цитрата натрия, расщеплению глюкозы, лактозы, сахарозы, мочевины, манита, инозита, сорбита, мальтозы, арабинозы, образованию сероводорода, индола и ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра), а также наличие ферементов -галактозидазы, дегидролазы аргинина, дезаминазы фенилаланина, декарбоксилаз лизина и орнитина. Используемая диагностическая система представляла собой планшет с лунками, содержащими соответствующий субстрат и индикатор, стабилизированный поливиниловым спиртом. Учет результатов биохимических тестов производили визуально через 18 часов после инкубации при температуре 370С (Erba RUS, Россия).
Способность к гидролизу крахмала изучали на картофельном агаре. Чашки Петри с суточной культурой бактерий на картофельном агаре заливали раствором Люголя. При гидролизе крахмала вокруг колоний бактерий формировались светлые участки. Изучение подвижности бактерий производили методом Шукевича.
В стерильные чашки Петри вносили по 1 мл суспензии из полученных суспезий и заливали расплавленным и охлажденным до 50С питательным агаром (МПА). Затем перемешивали вращательным движением содержимое чашек. Застывшие чашки помещали в термостат при 26 С. На третьи сутки подсчитывали количество колоний, выросших на чашках. Затем делали пересчет на 1 г почвы с учетом разведения.
В связи с высокой вариабельностью штаммов бактерий рода Bacillus с целью высокоточной видовой идентификации производили газожидкостную хроматографию, основанную на фиксации времени и индексов удерживания метиловых эфиров жирных кислот. Приготовление образцов для проведения хроматографии производили в соответствии со стандартным протоколом, рекомендуемым Sherlock Microbial Identification System (MIS) (Sasser, 1990). Оно включало в себя ряд этапов: культивирование микроорганизмов на плотной питательной среде, сапонификацию микробной культуры, метилирование жирных кислот и экстракцию эфиров.
На первом этапе производили выделение чистой культуры бактерий рода Bacillus и культивирование микроорганизмов на триптическом соевом агаре при температуре 280С в течение 24 часов. Далее с поверхности агара бактериологической петлей брали около 40 мг бактериальной культуры и помещали ее в пробирку, содержащую 1 мл реагента для проведения сапонификации (45 г гидроксида натрия, 150 мл метанола и 150 мл дистиллированной воды). Пробирки встряхивали и нагревали на водяной бане при температуре 1000С в течение 30 минут.
Далее осуществляли метилирование жирных кислот. Для этого в пробирку добавляли 2 мл реагента (325 мл 6М соляной кислоты, 275 мл метанола) и нагревали на водяной бане при температуре 800С в течение 10 минут. Далее производили экстракцию метиловых эфиров жирных кислот посредством добавления 1,25 мл реагента, приготовленного из смеси 200 мл гексана и 200 мл метил-терт-бутилового эфира. Пробирки взбалтывали на вортексе в течение 10 минут, после чего происходило разделение двух фаз - нижней (водной) и верхней (органической). Нижнюю фазу аккуратно собирали пипеткой и удаляли из пробирки. Затем в оставшуюся органическую фазу добавляли около 3 мл реагента (18,8 г гидроксида натрия, растворенного в 900 мл дистиллированной воды), встряхивали в течение 5 минут, пипеткой отбирали около 2/3 органической фазы и помещали в стеклянные виалы объемом 2 мл.
Микробиоценоз ризопланы C. pepo в различные стадии вегетации
В фазе всходов показатель колонизационной плотности бактерий семейства Enterobactenaceae составил 3,0±0,2 lg КОЕ/г, что занимало 65,2% от показателя общего микробного числа ризопланы. В фазе бутонизации бактерии семейства Enterobactenaceae также отличались максимальным значением показателя плотности колонизации, который составил 5,9±0,4 lg КОЕ/г (65,5 % от общего микробного числа ризопланы). В фазе цветения и плодоношения показатель колонизационной плотности энтеробактерий составил 5,8±0,6 lg КОЕ/г (66%) и 5,6±0,6 lg КОЕ/г (39,7%) соответственно. В ходе вегетации растения отмечалось изменение показателя колонизационной плотности спорообразующих бактерий семейства ВасШасеае. В фазе всходов данный параметр составил 0,7±0,1 lg КОЕ/г (15,2% от показателя общего микробного числа). Далее в фазе бутонизации происходило повышение значения показателя плотности колонизации до 1,2±0,3 lg КОЕ/г (13,5%). В фазе цветения растения достоверного изменения данного параметра не зафиксировано (1,2±0,2 lg КОЕ/г). В фазе плодоношения показатель плотности колонизации микробов семейства ВасШасеае достигал максимума и составил 5,7±0,6 lg КОЕ/г (40,4%).
Также было отмечено колебание показателей колонизационной плотности неферментирующих бактерий семейств Pseudomonadaceae. Изменения показателя плотности колонизации бактерий семейств Shewanellaceae и Moraxellaceae отмечено не было. В фазе всходов тыквы показатель колонизационной плотности микробов семейства Pseudomonadaceae составил 0,5±0,1 lg КОЕ/г (10,9% от показателя общего микробного числа ризопланы), Shewanellaceae и Moraxellaceae - 0,2±0,1 lg КОЕ/г и 0,2±0,1 lg КОЕ/г. В фазе бутонизации показатель колонизационной плотности псевдомонад составил 1,4±0,2 lg КОЕ/г, представителей семейств Shewanellaceae и Moraxellaceae составили 0,3±0,1 lg КОЕ/г и 0,2±0,2 lg КОЕ/г. В стадии цветения показатель плотности колонизации бактерий семейства Pseudomonadaceae не имел достоверных различий с соответствующим показателем предыдущей фазы и составил 1,1±0,3 lg КОЕ/г (7,9%). Показатель колонизационной плотности представителей Shewanellaceae и Moraxellaceae в данной фазе вегетации составил 0,3±0,1 lg КОЕ/г и 0,4±0,1 lg КОЕ/г соответственно. В фазе плодоношения растения показатель плотности колонизации бактерий семейства Pseudomonadaceae достигал максимального значения и составил 2,2±0,1 lg КОЕ/г (15,6%). Показатели колонизационной плотности микробов семейств Shewanellaceae и Moraxellaceae не имели достоверных различий с соответствующими параметрами предыдущих фаз вегетации и составили 0,3±0,1 lg КОЕ/г и 0,3±0,1 lg КОЕ/г соответственно. Таким образом, микробное сообщество ризосферы в процессе вегетации тыквы обыкновенной характеризовалось колебанием показателей частоты встречаемости видов. Максимальный показатель частоты встречаемости отмечался у В. subtilis.
В микробном сообществе ризосферы в процессе вегетации С. реро L. происходило увеличение показателя общего микробного числа с достижением максимальных значений в фазе плодоношения растения.
Значение показателя общего микробного числа ризосферы тыквы обыкновенной в процессе вегетации растения увеличивалось от 11,9±0,6 lg КОЕ/г в фазе всходов до 25,4±1,4 lg КОЕ/г (р 0,05) в фазе плодоношения. В фазе всходов и бутонизации наблюдалось повышение уровня колонизационной плотности представителей семейства Enterobacteriaceae, которое затем сменялось снижением данного показателя в стадии плодоношения. В то же время показатели колонизационной плотности бацилл (сем. ВасШасеаё) в ризосфере достоверно увеличивалась во все фазы роста С. реро, достигая максимальных значений в фазе плодоношения. Во все фазы онтогенеза растения максимальный показатель плотности колонизации отмечался у В. subtilis, достигая наибольшего значения в фазу плодоношения (5,4±0,3 lg КОЕ/г; р 0,05).
Видовой спектр ризопланы характеризовался сходством с видовым спектром ризосферы. Таксономический состав микробного сообщества ризопланы в процессе вегетации тыквы обыкновенной характеризовался изменением показателей частоты встречаемости видов. В фазе всходов С. реро максимальная частота встречаемости отмечена у В. subtilis. В стадии бутонизации доминирующее место по показателю частоты встречаемости занимали В. subtilis, P. pseudoalcaligenes и Е. amnigenes. В стадии цветения микробное сообщество ризопланы характеризовалось наибольшими показателями частоты встречаемости таких видов, как В. subtilis, S. odorifera и P. pseudoalcaligenes. В стадии плодоношения растения микробное сообщество характеризовалось преобладанием В. subtilis, энтеробактерий К. mobilis, S. odorifera и неферментирующих псевдомонад P. pseudoalcaligenes.
Показатель общего микробного числа ризопланы тыквы обыкновенной в процессе вегетации растения увеличивалось от 4,6±0,2 lg КОЕ/г в фазе всходов до 9,0±0,4 lg КОЕ/г (р 0,05) в фазе плодоношения. В фазе всходов и бутонизации наблюдалось повышение уровня колонизационной плотности представителей семейства Enter obacteriaceae, которое затем сменялось достоверным снижением данного показателя в стадии плодоношения. В то же время показатели колонизационной плотности бацилл (сем. ВасШасеаё) в ризосфере достоверно увеличивалась во все фазы роста С. реро, достигая максимальных значений в фазе плодоношения.
Из всех представителей видового сообщества ризопланы во все фазы онтогенеза растения максимальный показатель колонизационной плотности отмечался у В. subtilis, достигая наибольшего значения в фазу плодоношения (2,6±0,2 lg КОЕ/г; р 0,05). Далее были изучены морфологические и культурально - биохимические свойства выделенных бактерий.
Морфометрические и упруго-механические свойства B.subtilis, выделенных в различные стадии вегетации C. pepo
Как видно из таблицы, на долю указанных жирных кислот приходилось от 70,9% до 76,2% от общего количества жирных кислот, характерных для данного вида, поэтому данные о липидном составе мембран и процентное соотношение метиловых эфиров жирных кислот послужили хемотаксономическим маркером для видовой идентификации. В ходе проведения газожидкостной хроматографии было исследовано 415 штаммов B. subtilis, идентифицированных по морфологическим, культурально-биохимическим свойствам, из них у 375 штаммов (90,3%) хроматографический профиль жирных кислот был идентичен профилю B. subtilis базы данных Sherlock Microbial Identification System; Microbial ID, Inc., [MIDI], Newark, DE (Sasser, 1990).
Таким образом, таксономический состав ризосферы и ризопланы характеризовался сходством и был представлен пятнадцатью видами бактерий, относящихся к восьми родам и пяти семействам – Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Pseudomonadaceae, Moraxellaceae и Shewanellaceae. Однако, ризосфера имела значительно более высокие показатели колонизационной плотности по сравнению с ризопланой. Наибольшие показатели плотности колонизации отмечались у бактерий вида B. subtilis, достигавших максимума в фазу плодоношения (5,4±0,3 lg КОЕ/г).
В процессе вегетации C. pepo L. происходило увеличение значения общего микробного числа ризосферы с достижением максимальных значений в фазе плодоношения растения.
Значение показателя общего микробного числа ризосферы тыквы обыкновенной в процессе вегетации растения увеличивалось от 11,9±0,6 lg КОЕ/г в фазе всходов до 25,4±1,4 lg КОЕ/г (р 0,05) в фазе плодоношения. В фазе всходов и бутонизации наблюдалось повышение уровня колонизационной плотности представителей семейства Enterobacteriaceae, которое затем сменялось достоверным снижением данного показателя в стадии плодоношения. В то же время показатели колонизационной плотности бацилл (сем. Bacillaceae) в ризосфере достоверно увеличивалась во все фазы роста C. pepo L., достигая максимальных значений в фазе плодоношения. Во все фазы онтогенеза растения максимальный показатель плотности колонизации отмечался у B. subtilis, достигая наибольшего значения в фазу плодоношения (5,4±0,3 lg КОЕ/г; р 0,05). Таксономический состав микробного сообщества ризопланы в процессе вегетации тыквы обыкновенной характеризовался изменением показателей частоты встречаемости видов. В фазе всходов С. реро L. максимальная частота встречаемости отмечена у В. subtilis. В стадии бутонизации доминирующее место по показателю частоты встречаемости занимали В. subtilis, P. pseudoalcahgenes и Е. amnigenes. В стадии цветения микробное сообщество ризопланы характеризовалось наибольшими показателями частоты встречаемости таких видов, как В. subtilis, S. odonfera и P. pseudoalcaligenes. В стадии плодоношения растения микробное сообщество характеризовалось преобладанием В. subtilis, энтеробактерий К. mobilis, S. odonfera и неферментирующих псевдомонад Р. pseudoalcaligenes.
Значение общего микробного числа ризопланы было ниже, чем соответствующий показатель ризосферы. В ризоплане показатель общего микробного числа в процессе вегетации растения увеличивался от 4,6±0,2 lg КОЕ/г в фазе всходов до 9,0±0,4 lg КОЕ/г (р 0,05) в фазе плодоношения. В фазе всходов и бутонизации наблюдалось повышение уровня колонизационной плотности представителей семейства Enterobacteriaceae, которое затем сменялось достоверным снижением данного показателя в стадии плодоношения. В то же время показатели колонизационной плотности бацилл (сем. Bacillaceae) в ризосфере достоверно увеличивалась во все фазы роста С. реро, достигая максимальных значений в фазе плодоношения. Максимальное значение показателя колонизационной плотности отмечалось у В. subtilis, достигая наибольшего значения в фазу плодоношения (2,6±0,2 lg КОЕ/г; р 0,05).
Выделенные штаммы ризосферных микроорганизмов характеризовались типичными морфологическими и культурально-биохимическими свойствами. Однако, была отмечена фенотипическая изменчивость В. subtilis, которая проявлялась в способности образовывать различные типы колоний и вариабельности биохимической активности. В связи с чем идентификация В. subtilis осуществлялась на основе метиловых эфиров жирных кислот с помощью ГЖХ. Из 415 штаммов B. subtilis, идентифицированных по морфологическим, культурально-биохимическим свойствам, у 375 штаммов (90,3%) хроматографический профиль жирных кислот был идентичен профилю B. subtilis базы данных Sherlock Microbial Identification System; Microbial ID, Inc., [MIDI], Newark, DE (Sasser, 1990).