Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Классификация мочевых камней. 9
1.2. Эпидемиологические и этиологические факторы мочекаменной болезни. 10
1.3. Методы лечения мочекаменной болезни . 13
1.4. Роль микроорганизмов в камнеобразовании. 18
1.5. Биопленка: определение, методы исследования, формирование и средства борьбы с ними . 21
1.5.1. Методы исследования биопленок. 26
1.5.2. Роль биопленки в хронизации инфекционной болезни. 29
1.5.3. Современные подходы в борьбе с биопленками. 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 34
Глава 3. Результаты собственных исследований 41
3.1. Микроорганизмы образуют биопленки на мочевых камнях. 41
3.2. Микрофлора мочевых камней. 47
3.2.1. Тестирование уропатогенов на наличие уреазной активности и генов, кодирующих факторы патогенности . 51
3.2.2. Сравнительный анализ микробного пейзажа мочевых камней и мочи, забранной до оперативного вмешательства. 59
3.3. Влияние антибактериальных препаратов на процесс формирования биопленок и на уже сформированныебиопленки.
3.3.1. Влияние антибиотика.
3.3.2. Влияние препарата «лапрот» (на основе человеческого лактоферрина) и антибиотика ципрофлоксацина на рост и процесс образования биопленок клиническим изолятом Pseudomonas aeruginosa in vitro.
3.3.3. Влияние фаговых препаратов на процесс формирования биопленок клиническим изолятом Escherichia coll 71
3.4. Ультраструктура мочевых камней. 78
3.5. Зависимость формирования биопленок от химического состава камня. 81
3.6. Способность выделенных микроорганизмов формировать биопленки на поверхностях различной природы. 84
3.7. Экспериментальное моделирование процесса образования биопленки. 92
3.8. Действие препарата «споробактерин» при моделировании процесса образования биопленки на мочевых камнях. 94
ГЛАВА 4. Заключение 100
Выводы 103
Практическая значимость работы 104
Список литературы
- Методы лечения мочекаменной болезни
- Биопленка: определение, методы исследования, формирование и средства борьбы с ними
- Тестирование уропатогенов на наличие уреазной активности и генов, кодирующих факторы патогенности
- Влияние фаговых препаратов на процесс формирования биопленок клиническим изолятом Escherichia coll
Введение к работе
Актуальность исследования.
Проблема формирования бактериями биопленок широко изучается во всем мире. Огромное количество исследований, посвященных процессу образования биопленок, его генетическому контролю, выполненных на лабораторных моделях (на стекле или пластике, обеспечивающих экономичные подходы для широкомасштабных скрининговых экспериментов), позволили получить принципиальные знания о механизмах формирования биопленок патогенными бактериями.
Особенно важную роль биопленки играют в формировании очагов хронической инфекции при заболеваниях мочевыделительной системы. Мочекаменная болезнь (уролитиаз, МКБ) является одним из распространенных урологических заболеваний. По последним данным это заболевание встречается не менее чем у 3% населения всего мира (Лопаткин Н.А. и соавт. 2000). Инфекционные заболевания мочевыводящих путей (ИМП), являются прямыми или косвенными провокаторами МКБ (Вощула В.И. и соавт. 2007). При ИМП отмечается высокий уровень рецидивов инфекции, которая принимает характер хронической с частыми обострениями. При лечении МКБ широко используется различный инструментарий в виде дренажных систем, катетеров, стентов, на поверхности которых могут формироваться биопленки, что приводит к развитию «катетер-ассоциированной ИМП», или «биофильм-инфекции». (Costerton J. 1999; Романова Ю.М. 2004, 2011; Перепанова Т.С. 2012). Бактерии, инфицирующие мочевыводящие пути также способствуют новому камнеобразованию (Лопаткин Н.А. и соавт. 2000; Лопаткин Н.А. и соавт. 2007; Казеко Н.И. и соавт. 2008).
Интенсивное развитие современной молекулярно-биологической и электронно-микроскопической методической базы сформировало качественно новый уровень исследований, позволяющий анализировать развитие инфекционного процесса, непосредственно используя клинически доступные биоматериалы от больных. Основной стратегией борьбы с инфекционными осложнениями МКБ является антибиотикотерапия, которая в ряде случаев оказывается безуспешной. Особый интерес вызывает проблема неэффективного превентивного (предоперационного) назначения антибиотиков при удалении камней из почечной лоханки, так как в 87,5% случаев развивается пиелонефрит, при отрицательных данных бактериологического анализа мочи. Очевидно, что в этих случаях результаты бактериологического анализа мочи могут не отражать истинного профиля и состояния микрофлоры мочевых путей. Поэтому актуальной задачей остается проблема поиска альтернативной или дополнительной терапии инфекционных осложнений МКБ с помощью других антибактериальных препаратов, в механизме действия которых предусмотрено разрушение биопленок. Вышеизложенное, указывает на необходимость дальнейшего изучения патогенеза инфекционно-воспалительных осложнений при МКБ и поиска новых способов их лечения и профилактики.
Цель работы – Оценить роль бактериальных биопленок в хронизации инфекционного процесса при мочекаменной болезни и в развитии постоперационных инфекционных осложнений после удаления почечных камней.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
Исследование мочевых камней различными методами: электронно-микроскопическими, микробиологическими и молекулярно-генетическими.
Сравнение микрофлоры мочевых камней, удаленных оперативным путем, с микрофлорой мочи больных МКБ, взятой до проведения операции.
Характеристика выделенной микрофлоры по следующим признакам: способности к продукции уреазы, наличию генов, кодирующих факторы патогенности, способности образовывать биопленки на поверхности полимеров медицинского назначения
Изучение процесса образования биопленок на поверхности мочевых камней в эксперименте in vitro
Изучение в эксперименте воздействия антибактериальных препаратов на биопленки, сформированные клиническими изолятами.
Научная новизна
Впервые обнаружены бактериальные пленки на поверхности мочевых камней с помощью электронно-микроскопических методов исследований.
Способностью к образованию биопленки обладают все, выделенные из мочевых камней микроорганизмы, независимо от их уреазной активности.
Впервые выявлено, что интенсивность формирования биопленок уропатогенами на поверхности нативных мочевых камней зависит от рельефа и химического состава камня.
Частота выделения микроорганизмов у пациентов с МКБ непосредственно из камня значительно выше, чем из мочи.
Отрицательные бактериологические анализы мочи у больных с МКБ не являются доказательством стерильности мочевых камней.
Практическая значимость работы
На основании полученных результатов в ходе выполнения диссертационной работы написаны и одобрены на Совете по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» методические рекомендации: «Способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы» (протокол №27 от 10 октября 2013г.). Метод запатентован (№ 2461631 от 20.09.2012 г).
По результатам диссертационной работы разработаны и внедрены практические рекомендации в научно-исследовательскую практику Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт урологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Инфекционно-воспалительные осложнения и хронизация инфекционного процесса при мочекаменной болезни обусловлены существованием уропатогенных бактерий в составе биопленок на поверхности мочевых камней.
-
Интенсивность и скорость формирования биопленок на мочевых камнях зависят от рельефа и химического состава камней.
-
Субингибирующие концентрации антибактериальных препаратов стимулируют образование биопленок. Резистентные штаммы в присутствие антибактериальных препаратов также интенсивнее формируют биопленку.
Апробация работы:
Результаты диссертационной работы доложены на: Российских научно-практических конференциях с международным участием «Рациональная фармакотерапия в урологии», Москва, Дом ученых, февраль 2011, 2012 и 2013гг; конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Гурзуф, Украина. 2011, 2012 гг; Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» 26.04.2012 г; московской междисциплинарной научно-практической конференции «Современные подходы к лечению мочекаменной болезни в амбулаторной практике» (диагностика, метафилактика и реабилитация МКБ) в Научно-исследовательском центре, ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова МЗ РФ, ноябрь 2012 г; научно-практической конференции «Мочекаменная болезнь: профилактика и метафилактика» в ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России 23.11.12 г; научно-координационном совете ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России 12.02.13 г; XIII Конгрессе Российского общества урологов. 07.11.13 г; 10th Multinational Congress on Microscopy. Urbino. Italy. 2011; 6th ASM Conference on Biofilms. Miami. USA. 2012.
Исследование поддерживалось грантом РФФИ 10-04-01690.
Апробация диссертации состоялась 19 июня 2013 г. на научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Публикации
По результатам исследований в рецензируемых изданиях опубликовано 7 научных статей, из них 4 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также 9 тезисов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Материалов и методов исследования», «Результатов собственных исследований», «Выводов» и «Списка литературы» (80 отечественных и 86 зарубежных источников). Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 5 таблицами, 22 рисунками.
Методы лечения мочекаменной болезни
Этиология уролитиаза включает в себя экзогенные и эндогенные причины возникновения заболевания (Букин В.И. и соавт. 2000; Дасаева Л.А. и соавт. 2004; Борисов В.В., Дзеранов Н.К. 2006; Дзеранов Н.К., Лопаткин Н.А. 2007; Пигарова Е.А. и соавт. 2011; Ramello A. et al. 2000). Экзогенные причины заложены в окружающей среде человека: климат, биогеохимические особенности почв, воды, экологическая среда, особенности питания, социальные и другие факторы (Переверзев А.С., Россихин В.В. и соавт. 2004; Колпаков И.С. 2006). В понятие климат входят такие показатели, как температурный режим воздуха, влажность, осадки, инсоляция и др. Среди выше указанных климатических факторов на первом месте стоит механизм интенсивного испарения через кожу большого количества жидкости, при сухом жарком климате. В этих климатических условиях у людей значительно уменьшается диурез, иногда он составляет 500 мл в сутки. В результате этого резко повышается вязкость мочи за счет увеличения концентрации в ней коллоидных, кристалловидных компонентов и камнеобразующих веществ. Одновременно увеличивается кислотность мочи. Ее рН может достигать 5,5 и ниже.
Среди многих социальных факторов провоцирующих МКБ, гиподинамия стоит на первом месте. При гиподинамии снижаются метаболические процессы, что сопровождается избыточным накоплением камнеобразующих веществ в сыворотке крови. Повышение в сыворотке крови таких веществ, как кальций, фосфаты и мочевая кислота приводит к усилению их выделения почками (основным органом, участвующим в поддержании гомеостаза) и к перенасыщению мочи. В перенасыщенной моче происходит выпадение солей в виде кристаллов, что может в дальнейшем служить фактором образования сначала микролитов, а затем мочевых камней за счет оседания новых кристаллов (Букин В.И., Кучьмиева Г.М. и соавт. 2000; Голованова О.А., Борбат В.Ф. 2005; Fasano and Khan, 2001; Evan A. et al., 2005; Evan A. et al. 2006).
Последние годы в нашем обществе наблюдается чрезмерная пропаганда лекарственных форм витаминов. Значение витаминов в процессе жизнедеятельности человека сомнению не подвергается, но бесконтрольный прием и легкий доступ к этим препаратам, приводит зачастую к серьезным нарушениям здоровья. Доказано, что передозировка аскорбиновой кислоты более 1-3 грамма в сутки приводит к оксалатурии за счет эндогенного биосинтеза - перехода аскорбиновой кислоты в щавелевую. Витамин D и особенно его метаболиты - D2 (эргокальциферол) и D3 (холекальцийферол) являются важными регуляторами обмена кальция и фосфатов в организме человека. При длительном гипервитаминозе витамина D (в возрасте от 6 месяцев до 2 лет) наблюдаются необратимые изменения в почках. У некоторых больных имеет место кальциноз почечных сосочков, образуются чашечные камни с образованием фосфато-кальциевых камней (фосфатов) (Колпаков И.С. 2006; Калинченко СЮ. и др. 2012). В то же время недостаточность в пище витамина А может косвенно способствовать развитию фосфатурии (нарушение фосфорно-кальциевого обмена) и фосфатного камнеобразования. При лечении эндогенной гипроксалемии пиридоксином (витамин В6) уровень щавелевой кислоты в крови и в моче снижается.
Проблема питания, как фактора риска развития МКБ сложна и многогранна. Пища с высоким содержанием животного белка, приводит к увеличению выделения кальция, оксалатов, уратов и уменьшению количества цитратов в моче. Побочный эффект высокого потребления NaCl и, как результат, повышение экскреции кальция, достаточно изучен многими исследователями. Употребление грейпфрутового сока повышает риск образования камней, за счет экскреции цитрата. Апельсиновый и лимонный соки не стимулируют образование камней, хотя также имеют высокое содержание цитрата. По мнению некоторых исследователей, употребление чая, кофе, белого вина снижает риск камнеобразования, что связанно со способностью кофеина и алкоголя ингибировать антидиуретический гормон.
Этиологическими факторами уролитиаза также могут служить некоторые химические вещества и медикаменты, например сульфаметоксазол, тетрациклин, нитрофураны, триамтерен, сульфонамиды. Длительный прием цитратных препаратов, содержащих лимонную кислоту и ее соли, может осложниться нежелательной побочной реакцией — оксалатурией (Переверзев А.С., Россихин В.В. и соавт. 2004).
Эндогенные факторы, провоцирующие МКБ, заложены в организме человека. Они могут быть генетическими, врожденными и приобретенными в процессе жизни. К ним следует отнести изменения тканей почки, патологические изменения почек (Kim S.C. et al. 2005), мочевыводящих путей (Wawro A., Zwolinska D. et al. 2000), нарушение микроциркуляции в почках и наличие в них инфекции (Вощула В.И., Лыш Е.Я., Станкевич СИ. 2007., Сулейманов СИ. и соавт. 2010), изменения состава мочи, усиленное выделение литогенных веществ, нарушение баланса между ингибиторами и промоторами кристаллообразования, стойкие сдвиги показателей мочи.
Нередко факторами МКБ являются инородные тела и дренажные системы мочевых путей. К ним относятся фрагменты дренажных трубок, катетеров, не рассасывающийся шовный материал, салфетки, детали эндоскопических приборов, а так же нефростомы, стенты, цистостомы, постоянные катетеры, которые применяются в процессе лечения больного. Условно к «инородным телам» можно отнести сгустки крови, фрагменты собственных некротизированных тканей, на которых часто формируются вторичные камни. Для процессов инкрустации мочевых солей на инородных телах существует физическое правило: практически все, что находится в мочевых путях и не покрыто уротелием, всегда подвержено солевой инкрустации.
Биопленка: определение, методы исследования, формирование и средства борьбы с ними
Тестирование выделенных микроорганизмов на способность к формированию бактериальных биопленок проводили по общепринятой методике в 96-ти луночных микротитровальных планшетах (O Toole G.A. et al. 2000). Способ определения заключается в культивировании бактерий в лунках полистироловых микротитровальных планшет с последующей окраской адгезировавшихся к твердой фазе и сформировавших биопленку бактерий.
Ночные культуры тестируемых изолятов разводили стерильной питательной средой до концентрации пх10бКОЕ/мл и вносили по 100 мкл в лунки микротитровальных планшет (в 4 повторах). Планшеты инкубировали в течение 24 часов при 37 С. В качестве контроля фона использовали лунки, заполненные стерильной питательной средой. После инкубирования оценивали оптическую плотность выросших за сутки планктонных клеток на фотометре iEMS Reader MF (Labsystems, Швеция), при длине волны 540 нм. Затем питательную среду с планктонными клетками удаляли, вносили по 100 мкл раствора красителя (1% спиртовой раствор кристалл виолета) в каждую лунку и оставляли на 45 минут при комнатной температуре. После этого краситель удаляли, лунки промывали 3 раза дистиллированной водой для удаления не связавшегося красителя. Затем в лунки вносили по 100 мкл этилового спирта и оставляли на 1 час для экстрагирования красителя, связавшегося с клетками биопленок на стенках полистироловых лунок. Интенсивность окрашивания спиртового раствора, оцениваемая на фотометре при длине волны 540 нм, отражает количество сформированной биопленки. Данные по оценке оптической плотности выросших планктонных клеток, а также оптической плотности окраски спиртового экстракта красителя представляли в виде диаграмм.
Изучение влияния различных препаратов на процесс формирования биопленки проводили следующим способом: ночные культуры тестируемых клинических изолятов разводили стерильной питательной средой до концентрации пхЮ6 КОЕ/мл и добавляли необходимое количество исследуемого препарата в нужной концентрации. Суспензии тщательно перемешивали и вносили по 100 мкл в лунки микротитровальных планшет (в 4 повторах). Планшеты инкубировали в течение 24 часов при 37 С. В качестве положительного контроля, в лунки вносили по 100 мкл соответствующего разведения суспензии бактерий без добавления химических веществ или препаратов, а в качестве контроля фона использовали лунки, заполненные стерильной питательной средой. После инкубирования оценивали оптическую плотность, как описано выше.
Изучение влияния различных препаратов на уже сформированные биопленки проводили следующим способом: клетки испытуемых клинических изолятов в течение суток формировали биопленки в лунках микротитровальных планшет в питательной среде без добавления тестируемых компонентов. Затем питательную среду с планктонными клетками удаляли и сформировавшиеся на стенках лунок биопленки 3 раза осторожно промывали стерильной дистиллированной водой (по 400 мкл в каждую лунку), стараясь не повредить сформировавшиеся биопленки. В 4 лунки, которые служили контролем образовавшейся за сутки биопленки, вносили раствор красителя и окрашивание проводили по стандартной методике. В лунки, которые должны служить контролем продолжающегося на вторые сутки процесса формирования биопленки вносили по 100 мкл стерильной питательной среды (LB), а в лунки каждого варианта опыта вносили последовательные разведения тестируемого препарата в питательной среде (по 100 мкл). Планшеты инкубировали 4 часа при 37 С. Затем на фотометре оценивали оптическую плотность вновь выросших за 4 часа планктонных клеток. После этого содержимое лунок удаляли, вносили в лунки раствор красителя и далее действовали по описанной выше методике. Эксперименты по изучению процесса формирования бактериальных биопленок микроорганизмами, выделенными из мочевых камней, проводили на следующих материалах:
Лубрицированный катетер EasiCath - изготовлен из поливинилхлорида (ПВХ) и по всей поверхности покрыты гидрофильным лубрикантом (поливинилпирролидон), который активируется при контакте с водой.
Катетер Фолея 2-х ходовой, 2-х ходовой женский и 3-х ходовой - изготовлен из высококачественного латекса, покрытого силиконом.
Катетер Нелатона - изготовлен из прозрачного имплантационно-нетоксичного поливинилхлорида.
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Исследования проводили в двулучевом электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI Compani, USA) в режиме высокого вакуума. Исследования проводили на 12 мочевых камнях, удаленных методом перкутанной литотрипсии. Для проведения исследования методом СЭМ, мочевые камни сразу же после извлечения в операционном блоке фиксировали в 10% формалине или методом Ito-Karnovsky (Ito S. and Karnovsky M.J. 1968). Перед проведением СЭМ зафиксированный материал напыляли слоем золота или углерода толщиной 5 nm с помощью напылительной установки (SPI Inc) USA. Такой способ подготовки препарата позволяет свести к минимуму изменения структуры изучаемого объекта.
Рентгеновский микроструктурный анализ элементного химического состава мочевых камней определяли на микроскопе Quanta 200 3D (FEI Compani, USA) с приставкой «Эдекс». Приставка позволяет исследовать качественное и количественное содержание химических элементов, кроме водорода, легких радиоактивных элементов и изотопов.
Статистическая обработка результатов. Все эксперименты in vitro проводили в нескольких повторах, но не менее Зх раз. Средние значения и стандартные ошибки подсчитывались в программе Excel, входящей в программное обеспечение Microsoft Office 2007.
Тестирование уропатогенов на наличие уреазной активности и генов, кодирующих факторы патогенности
Мочекаменная болезнь (уролитиаз, МКБ) является одним из распространенных урологических заболеваний. По последним данным это заболевание встречается не менее чем у 3% населения всего мира. Оперативные методы лечения мочекаменной болезни применяются в тех случаях, когда заболевание сопровождается различными осложнениями. В настоящее время в хирургии, в том числе и в урологии, предпочитают мало инвазивные методы лечения. Они имеют преимущество перед традиционными оперативными вмешательствами, так как сопровождаются меньшим числом осложнений, меньшей кровопотерей, меньшим стрессом и более коротким периодом восстановления после операции. Операции выполняются с применением эндоскопического оборудования. Современные нефроскопы и уретроскопы очень тонкие и гибкие, что позволяет проводить хирургическое лечение без серьезных повреждений органов мочеполовой системы. Но, к сожалению, результаты лечения с использованием современных методов не всегда удовлетворяют врачей своими результатами, что обусловлено как возникновением большого числа осложнений, так и высокой частотой развития рецидивов камнеобразования. Наиболее частым послеоперационным осложнением мало инвазивных операций является острый пиелонефрит.
До проведения планового оперативного вмешательства все пациенты проходят стандартные клинико-лабораторные обследования. Согласно результатам бактериологического исследования мочи проводят предоперационную антибактериальную подготовку. При выраженной бактериурии предварительно проводят курс антибактериальной терапии. Всем пациентам перед инвазивными вмешательствами в качестве антимикробной профилактики внутривенно вводят антибактериальные препараты широкого спектра действия (фторхинолоны, защищенные бета-лактамные антибиотики, цефалоспорины) за 30-60 минут до основного момента вмешательства (разреза кожи, дробления камней). Любое оперативное вмешательство проводится на фоне санированной мочи или значительного снижения микробного числа в моче. Однако по наблюдениям практикующих урологов даже на фоне санированной мочи нередки постоперационные инфекционные осложнения. При открытых операциях и мало инвазивных методах оперативного лечения это явление еще можно объяснить заражением госпитальными инфекциями через разрезы и катетеры. Но эти аргументы бессильны при инфекционных осложнениях после проведения ДУВЛ (дистанционная ударно-волновая литотрипсия), так как при этом методе лечения никаких разрезов не делают. Очевидно, развитие инфекций связано с разрушением целостности мочевых камней, которые инфицированы еще до операции. По-нашему предположению, патогенные микроорганизмы, инфицирующие почки, в таких случаях существуют в виде биопленок и именно биопленки могут служить причиной инфекционных осложнений и хронизации воспалительного процесса при уролитиазе. Удаленные оперативным путем или самостоятельно отошедшие мочевые камни, согласно существующему алгоритму, которым руководствуются урологи, направляются на биохимическое исследование минерального состава или выдаются пациентам как сувенир. Поскольку целью нашей работы было выяснение роли бактериальных биопленок в хронике мочекаменной болезни, нам нужны были камни, полученные непосредственно во время операции. Для этого, работающие с нами хирурги после извлечения мочевых камней помещали их в стерильную посуду с 10% формалином или раствором Ito-Karnovsky, и в тот же день отправляли в нашу лабораторию для дальнейшего исследования. Для проверки нашего предположения о дооперационной инфицированности мочевых конкрементов и существования биопленок на их поверхности, были изучены 19 мочевых камней, удаленных методом перкутанной нефролитолапаксии. Исследования проводили с помощью двулучевого электронного микроскопа Quanta 200 3D. Этот микроскоп позволяет изучать не обработанный агрессивными фиксирующими и красящими веществами материал, что является принципиальным аспектом при изучении бактериальных биопленок. При изучении камней диаметром более 1см мы дробили их на несколько сравнительно мелких фракций и изучали поверхность искусственного скола по сагиттальной линии. Зафиксированный материал напыляли слоем золота или углерода толщиной 5 нм с помощью напылительной установки (SPI Inc) USA. Такая подготовка материала является максимально щадящей для сохранения структуры бактериальной биопленки.
С помощью мобильных механизмов микроскоп Quanta 200 3D дает возможность визуализировать исследуемый объект в трех плоскостях. Поэтому, были изучены проксимальные (обращенные в полость почечной лоханки), дистальные (обращенные к стенке почечной лоханки) поверхности камней и поверхность искусственного скола по сагиттальной линии. По данным СЭМ, рельеф поверхности раздробленных мочевых камней был очень разнообразен: практически гладкий, бугристый, с включениями кристаллов с острыми краями, с округлыми пористыми образованиями, объединенными в конгломераты. В одном и том же камне обнаруживались разные виды поверхностей и кристаллоподобных включений (рис.1). /«
Кристалообразное включение с острыми краями . Увеличение 6000Х. При исследовании методом СЭМ на поверхности мочевых камней визуализировались бактериальные клетки под плотным слоем матрикса (а), рыхлые (в) и плотные слизистые образования с перфорацией (б, г). Морфология обнаруженных образований была полностью идентична структуре биопленок, наблюдаемых в экспериментальных исследованиях, которые проводились ранее в нашем институте (рис.2).
в) Плотное слизистое образование на мочевом камне . Увеличение 1200Х. Таким образом, проведенные электронно-микроскопические исследования нативных почечных камней позволили нам убедиться в правильности нашего предположения о том, что у пациентов с мочекаменной болезнью микроорганизмы способны существовать в биопленочном состоянии на мочевых камнях. Именно благодаря биопленочному росту они остаются жизнеспособными после предоперационной антибиотикотерапии, которая приводит только к стерильности мочи, где эти бактерии находятся в свободном планктонном состоянии. Стерильность мочи или незначительное количество микробов в моче дает основание хирургам приступить к операционному вмешательству. При дроблении или удалении мочевых камней из поврежденных биопленок высвобождаются свободные бактерии и отрываются целые куски биопленок. В результате этого происходит обсеменение органов мочевыделителъной системы теми возбудителями, которые инфицировали мочевые камни. Эти возбудители заново формируют биопленки на поврежденных тканях органов мочевыделительной системы или на осколках мочевых камней, служа не только источником поддержания хронического инфекционного и воспалительного процесса, но также причиной рецидивов уролитиаза. Более того, отсутствие подтвержденных микробиологическими методами данных о наличие бактериальных биопленок на удаленных оперативным путем мочевых камнях, влечет за собой неадекватное послеоперационное антибактериальное лечение.
После того как с помощью двулучевого электронного микроскопа Quanta 200 3D было показано наличие биопленок на мочевых камнях при отсутствии инфекции в моче, мы приступили к подробному микробиологическому, молекулярно-генетическому и электронно-микроскопическому исследованию мочевых камней. 3.2. Микрофлора мочевых камней В исследования были включены 203 пациента с камнями в почках и мочевых путях, которым были проведены различные плановые оперативные вмешательства. Материал для исследований наша лаборатория получала в среднем 2-3 раза в неделю в течение 3 лет. 153 пациента проходили лечение в ФГУ «НИИ Урологии» Минздравразвития России, 50 пациентов - в ГКБ им. Н.Н. Боткина. Средний возраст пациентов составил 39 лет (от 1 года до 77 лет). Дети проходили лечение в специализированном отделении детской урологии.
Полученные мочевые камни помещали в стерильную посуду с питательной средой (L-бульон) и инкубировали 24 час. Далее, смывы мочевых камней были изучены микробиологическими и молекулярно-генетическими методами. Микробиологическими методами был определен спектр возбудителей, выделяющихся при высеве мочевых камней. Обобщенные результаты высевов с 184 мочевых камней, полученных из двух больниц показали, что наиболее часто выделяются бактерии Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Escherichia coli. Бактерии Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumanii, Candida albicans и Morganella morganii выделяются реже (табл.1).
Проведенные исследования показали, что около 50% (91) мочевых камней инфицированы и в большинстве случаев инфекция носит сочетанный характер (табл.1). В таблице представлены сводные результаты микробиологического исследования мочевых камней. Согласно врачебной этике ФИО пациентов закодированы и им присвоены номера в соответствии с порядком поступления материала для исследования.
Влияние фаговых препаратов на процесс формирования биопленок клиническим изолятом Escherichia coll
Далее мы изучили влияние ЛФ на уже сформированные биопленки. Результаты типичного опыта приведены на рис 6 б). Представленные на рис. 11 данные показывают, что присутствие ЛФ в питательной среде (даже в низких концентрациях - 0,4 мг/мл) не позволяло бактериям выходить из сформировавшихся биопленок и свободно размножаться. Однако, лактоферрин (даже в самой высокой дозе - 2,0 мг/мл) почти не снижал интенсивность уже сформированных за 1 сутки биопленок. Таким образом, было установлено, что лактоферрин в определенных концентрациях может влиять на динамику процесса биопленкообразования у псевдомонад, снижая его интенсивность, но почти не влияет на уже сформировавшиеся биопленки.
Основываясь на данных ранее проведенных исследований, в которых было показано, что действие отдельно препарата лактоферрина и отдельно антибиотика ципрофлоксацина на уже сформированные биопленки не приводит к желаемому эффекту разрушения биопленок, мы решили проверить сочетанное действие этих препаратов на динамику процесса образования биопленок псевдомонадами.
В опытах по изучению совместного влияния ЛФ и АБ на формирование биопленок псевдомонадами, была выбрана подпороговая концентрация ципрофлоксацина - 0,04мкг/мл - при которой планктонные бактериальные клетки почти не размножались, но всё же формировали довольно интенсивные биоплёнки. Концентрации же ЛФ при этом варьировали от заведомо низких (0,1 и 0,3мг/мл) до достаточно высокой (0,7мг/мл). Результаты типичного опыта представлены на рис. 6 в).
Представленные данные показывают, что возрастающие концентрации ЛФ в питательной среде почти не влияют на размножение планктонных клеток, но резко снижают процесс биопленкообразования (левая половина рис. 6 в). Однако значения интенсивности окрашивания биопленок в лунках с высокой дозой ЛФ остаются всё же в несколько раз выше фоновых значений. Ципрофлоксацин, добавленный в питательную среду в подпороговой дозе 0,04мкг/мл, не позволял планктонным бактериальным клеткам размножаться. Однако при этом псевдомонады могли активно формировать полноценные биопленки. Добавление низких доз (0,1 и 0,3 мг/мл) ЛФ к суспензиям с АБ в дозе 0,04 мкг/мл не оказывало видимого воздействия на процесс биопленкообразования. В данном случае на размножение бактериальных клеток и формирование биопленок оказывал влияние только антибиотик. При увеличении концентрации ЛФ до 0,5 и 0,7мг/мл начинает сказываться и его влияние на процесс формирования биопленок (левая часть рис.6 в). Значения интенсивности биопленок в лунках со смесью АБ (0,04мкг/мл) и ЛФ (0,5 и 0,7мг/мл) в несколько раз ниже значений в случае использования только АБ и почти в 2 раза ниже значений при добавлении только лишь ЛФ. Это особенно заметно при совместном воздействии АБ в дозе 0,04мкг/мл и ЛФ в дозе 0,7мг/мл (предпоследняя правая триада столбцов). В этом случае подпороговые дозы антибиотика не дают бактериям размножаться, а пороговые концентрации лактоферрина препятствуют процессу интенсивного биопленкообразования. Следует отметить, что в терапевтической практике для усиления эффекта действия антибиотика ципрофлоксацин применяется в дозах, создающих в крови концентрацию 2,1 - 4,6 мкг/мл активного вещества. Мы же в своих экспериментах использовали концентрацию антибиотика в 50 раз меньшую, чем в терапии.
Комбинированный эффект воздействия ЛФ и АБ заключается в том, что при использовании низких концентраций антибиотика, интенсивность процесса формирования биопленок клетками культуры P.aeruginosa значительно уменьшается. Такая тактика лечения может оказаться эффективной альтернативой при лечении больных с урологическими проблемами на фоне иммунодефицита, с целью предотвращения возникновения у них очагов хронической инфекции, связанных со способностью возбудителя формировать биопленки.
За последние годы вновь возник интерес к возможностям терапевтического использования бактериофагов. Фаговые препараты в урологии применяют не только в лечебных целях, но так же и с целью профилактики послеоперационных осложнений. Так как ранее проведенные исследования показали, что антибиотикотерапия мало эффективна в отношении биопленок, мы изучили влияние фаговых препаратов на процесс формирования биопленок. В эксперименте мы изучили действие известных коммерческих фаговых препаратов «секстафаг» и «бактериофаг колипротейный». Указанные выше препараты представляют собой смесь стерильных фильтратов фаголизатов бактерий (в том числе и кишечной палочки). Из нашей коллекции микроорганизмов, выделенных из мочевых камней для проведения исследования мы выбрали клинический изолят Escherichia coli. Выбранный нами клинический изолят был чувствителен к фаговому препарату «Бактериофаг колипротейный» и в то же время являлся резистентным по отношению к «секстафаг»-у. На первом этапе нашей задачей было установить титры бактериофагов, входящих в препараты, так как производители в аннотации этого не указывают. Методами Апельмана и Грация было установлено, что титр фага в препарате «Бактериофаг колипротейный» не превышает 105 БОЕ/мл, а в препарате «Секстафаг» 104 БОЕ/мл. Количественный анализ влияния бактериофагов на процесс формирования биопленки проводили, как описано в разделе «Материалы и методы».
На рис. 7 а) представлена диаграмма, показывающая влияние бактериофага в разных титрах (от 105БОЕ и ниже), на процесс формирования биопленок клиническим изолятом Escherichia coli. В результате выявлена зависимость формирования биопленки от количества добавленного фага. Оказалось, что бактериофаговый препарат «бактериофаг колипротейный» в титре ниже 103 БОЕ/мл стимулирует образование биопленки Escherichia coli по сравнению с контролем без добавления фага. Более того, образование биопленки стимулирует и фаговый препарат «секстафаг» к которому исследуемый клинический изолят резистентен (рис. 7 б).