Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 8
1.1. Формирование активных форм кислорода и их токсическое действие на основные компоненты клетки 9
1.1.1. Формирование АФК. 9
1.1.2. Повреждающее действие АФК на компоненты клетки 11
1.2. Общие регуляторные механизмы адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям 15
1.2.1. Двухкомпонентные сигналпроводящие системы 16
1.2.2. «Ощущение кворума» 17
1.2.3. Белки, сочетающие свойства сенсоров и транскрипционных регуляторов 19
1.2.4. Факторы 19
1.2.5. Влияние топологического состояния ДНК на генную экспрессию 21:
1.2.6. Регуляция адаптивного ответа на посттранскрипционном уровне 22
1.3. Особенности адаптивного ответа микроорганизмов на окислительный стресс 23
1.3.1. Регулоны защиты от окислительного стресса 24
1.3.2. Детоксикация АФК 28
1.3.3. Ограничение поступления АФК в клетку 30
1.3.4. Активный выброс из клетки генераторов АФК 31
1.3.5. Биосинтез изоферментов устойчивых к АФК 32
1.3.6. Регуляция уровня ионов металлов 33
1.3.7. Регенерация и репарация повреждений 34
1 А. Полиамины. Физиологическая роль полиаминов 36
1.4.1. Пути биосинтеза полиаминов 37
1.4.2. Физиологическая роль полиаминов 38
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 46
2.1. Объекты исследования и условия культивирования 46
2.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток Escherichia coli 48
2.3. Трансформация Escherichia coli плазмидной ДНК 49
2.4. Определение степени суперспирализации ДНК 50
2.5. Определение содержания полиаминов в клетке и в среде 51
2.6. Определение активности ферментов пол нами нсинтезирующейси стемы 52
2.7. Определение активности Р- галактозидазы 53
2.8. Определение содержания белка 54
2.9. Определение частоты мутаций 54
2.10. Подсчет числа живых клеток 55
2.11. Статистическая обработка данных 55
ГЛАВА 3. Роль полиаминов в регуляции экспрессии генов oxyR регуло на Escherichia colt 56
3.1. Отклик системы синтеза полиаминов на окислительный стресс как индикатор их возможной роли в антиоксидантной защите 56
3.2. Влияние окислительного стресса на экспрессию гена oxyR 58
3.3. Влияние полиаминов на экспрессию генов антиоксидантной защиты 61
3-4. Специфичность эффекта полиаминов на экспрессию генов окислительного стресса 70
ГЛАВА 4. Влияние путресцина на экспрессию адаптивных генов через изменение топологии ДНК 74
4.1. Роль полиаминов в регуляции топологии ДНК в условиях, окислительного стресса 74
4.2. Влияние путресцина на экспрессию гена oxyR через изменение топологического состояния ДНК 78
ГЛАВА 5. Полиамины как ДНК-протекторы в процессе адаптации Escherichia coli к окислительному стрессу 83
5.1. Роль путресцина в защите ДНК от разрывов, индуцированных АФК 83
5.2. Влияние путресцина на частоту мутаций и выживаемость Е, coli при окислительном стрессе 85
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов. 88
6.1. Роль полиаминов в регуляции экспрессии генов oxyR регулона Escherichia coli 88
6.2. Влияние путресцина на экспрессию адаптивных генов через изменение топологии ДНК 95
6.3: Полиамины как ДНК-протекторы в процессе адаптации Escherichia coli к окислительному стрессу 99
Заключение 102
Выводы 106
Литература 107
- Регулоны защиты от окислительного стресса
- Влияние окислительного стресса на экспрессию гена oxyR
- Роль полиаминов в регуляции топологии ДНК в условиях, окислительного стресса
- Влияние путресцина на частоту мутаций и выживаемость Е, coli при окислительном стрессе
Введение к работе
Актуальность проблемы. В природных популяциях бактерии находятся под действием постоянно меняющихся условий окружающей среды. В процессе эволюции у микроорганизмов формировались и совершенствовались механизмы, позволяющие выживать при резких изменениях параметров среды, которые можно определить как стресс, а факторы их вызывающие - как стрессовые. Изучение процессов адаптации микроорганизмов к стрессу в настоящее время является одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений микробиологии. Окислительный стресс относится к наиболее распространенным видам неблагоприятных воздействий внутренней или внешней среды. Он возникает в результате действия на клетку активных форм кислорода. Согласно одной из гипотез, любой вид неблагоприятных воздействий в конечном итоге приводит к развитию окислительного стресса (Aldsworth et al.> 1999). Это происходит в результате нарушения сопряжения энергетического и конструктивного метаболизма что, по сути, происходит в той или иной степени в любых стрессовых: ситуациях. Избыток энергии, возникающий в этих условиях, способствует образованию свободных радикалов, которые повреждают различные клеточные структуры, что в конечном итоге может, привести к гибели клетки..
Использование микроорганизмов в качестве модели для: изучения повреждающего эффекта активных форм кислорода на клетку приобретает актуальность в связи с тем, что свободные радикалы в некоторых случаях являются причиной злокачественного перерождения эукариотических клеток, механизмы которого остаются во многом не исследованными. Кроме того, повреждение различных клеточных компонентов, вызванное активным кислородом, может быть одной из причин старения и возникновения различных заболеваний человека и животных.
Интенсивные исследования в области микробиологии и молекулярной биологии обеспечили значительный прогресс в изучении генов и закодированных в них белков, участвующих в адаптации микроорганизмов к окислительному стрессу (Demple, 1999). Вместе с тем вопрос о механизмах, лежащих в основе регуляции стрессовых реакций клеток во многом остается не изученным. В частности, недостаточно полно исследована роль метаболических факторов в регуляции адаптивного ответа клетки на транскрипционном уровне. Среди факторов метаболической регуляции в последние годы особенно возрос интерес к биогенным полиаминам. Показано участие этих клеточных компонентов во многих реакциях макромолекулярного синтеза, включая репликацию ДНК, транскрипцию,, трансляцию, биосинтез фосфолипидов и другие процессы жизнеобеспечения і клетки (Igarashi, Kashiwagi, 2000).
В последнее время появилось множество данных о том, что полиамины могут оказывать влияние на клеточные процессы как у микроорганизмов так и у эукариот. Известно, что эти соединения участвуют в регуляции не только нормального клеточного цикла, но и выполняют очень важные функции в патогенезе злокачественных новообразований (Tatib et al.r 1998; Sandgren et al.y 2003). Многие данные свидетельствуют о том, что полиамины могут быть мишенью для терапевтического вмешательства в случае некоторых типов рака (Thomas, Thomas, 2001) и паразитарных инфекциях (Fairlamb, Le Quesne, 1997). Некоторые авторы отмечают также участие полиаминов в процессе запрограммированной клеточной смерти (Shipper, 2000; Thomas et aL, 2001; Nitta et al., 2002), но вопрос этот требует дальнейшего изучения.
Особенность молекулярной структуры полиаминов, определяет их роль как биогенных поли катионов, которые реагируют с отрицательно заряженными компонентами клетки, главным образом с ДНК (Kashiwagi et al.y 1986). В то же время имеются данные о регуляции полиаминами промоторной активности некоторых генов эукариот (Bryans et а/., 1996). Эти; свойства полиаминов, а также влияние, которое они оказывают на адаптацию клеток Е. coli к осмотическому, тепловому и др. видам стрессовых воздействий (Ткаченко и др. 1996, 1997, 1998), обосновывают необходимость изучения их роли в адаптации микроорганизмов к окислительному стрессу, в частности возможного влияния на экспрессию генов пероксидного стресса. Целью данной работы является выяснение роли полиаминов в адаптации Е. coli к условиям окислительного стресса, индуцированного перекисью водорода. Исходя из цели работы, были поставлены следующие основные задачи:
Исследовать активность ферментов системы синтеза полиаминов в условиях окислительного стресса.
Изучить влияние полиаминов на уровень экспрессии генов ахуЛ-регулона под действием; перекиси- водорода и его зависимость от глубины стрессового воздействия.
Охарактеризовать влияние полиаминов на топологию ДНК при окислительном стрессе.
Изучить влияние степени суперспирализации ДНК на экспрессию < гена oxyR под действием перекиси водорода.
Дать оценку защитных: функций полиаминов в зависимости от повреждения ДНК активными формами кислорода в системе in vitro.
Изучить антимутагенные свойства путресцина.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые установлена роль полиаминов как транскрипционных регуляторов экспрессии генов адаптации Е. coli к пероксидному стрессу.. Регуляторный эффект выявлен как в отношении гена, кодирующего транскрипционный регулятор пероксидной защиты, так и в отношении гена — мишени данного регулона.
Показана зависимость топологии ДНК от концентрации путресцина и активности гена. oxyR от степени отрицательной суперспирализации ДНК. На основе этого сделан вывод о роли путресцина как модулятора топологического состояния ДНК в механизме транскрипционной регуляции генов oxyR регулона.
Ранее неизвестными являются данные о роли путресцина в защите ДНК от разрывов в условиях реакции Фентона в системе in vitro. Результаты, демонстрирующие наличие у путресцина антимутагенных свойств и положительный эффект этого диамина на количество живых клеток в культуре в условиях окислительного стресса также являются новыми.
Полученные результаты расширяют представление о механизме действия полиаминов в регуляции клеточного метаболизма и определяют роль этих поликатионов в ; модуляции адаптивного ответа Е. coli на окислительный стресс как:. 1) модуляторов транскрипции адаптивных генов; 2) протекторов ДНК; 3) антимутагенных факторов.
Материалы диссертации использованы при составлении курса лекций «Адаптация микроорганизмов к стрессу», входящего в программу обучения на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского Государственного Университета.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Окислительный стресс индуцирует систему синтеза полиаминов, продукты которой обладают способностью стимулировать экспрессию генов антиоксидантной защиты.
Путресцин обладает модулирующей . активностью в отношении топологических свойств ДНК, направленной на повышение уровня экспрессии генов антиоксидантной защиты.
Возрастание количества жизнеспособных клеток в культуре при окислительном стрессе обусловлено свойствами полиаминов как модуляторов генной экспрессии и ДНК-протекторов, снижающих частоту мутаций.
Регулоны защиты от окислительного стресса
Детоксикация активных форм кислорода, предотвращение их накопления в клетке, исправление уже имеющихся повреждений и другие функции, необходимые для выживания клетки в условиях окислительного стресса, осуществляются специфическими ферментами, синтез большинства из которых в отсутствие АФК находится на низком уровне. В условиях окислительного стресса количество этих ферментов в клетке значительно увеличивается. Гены, кодирующие ферменты защиты от окислительного стресса организованы в виде регулонов, специфически реагирующих на наличие в среде АФК путем повышения уровня генной экспрессии.
Известно, что в присутствии супероксид-генерирующих агентов у Е. coli увеличивается уровень приблизительно 30 белков (Demple, 1991; Storz et al., 1990). Гены, кодирующие эти белки, объединенны в SoxRS регулон. Его экспрессия находится; под контролем транскрипционных регуляторов SoxR и SoxS (Gaudu et aL, 1997). Белок SoxR присутствует в клетке постоянно в небольшом количестве (Gaudu, Weiss, 1996). Его содержание практически не меняется даже в условиях супероксидного стресса (Wu, Weiss, 1991), так как он, обладая высокой аффинностью к ДНК, связывается с промоторной областью генов - soxR и soxS и репрессирует собственную транскрипцию (Gralla, Collado-Vides, 1996). Уровень экспрессии гена soxS в нормальных условиях минимален, но резко возрастает в условиях окислительного стресса. Индукция этого гена зависит от состояния белка SoxR, который является активатором транскрипции soxS. В активации SoxR принимают участие два [2Fe-2S] кластера. Их окисление приводит к изменению конформации молекулы белка (Ding et aL, 1996). Далее окисленный SoxR стимулирует транскрипцию soxS, продукт которого специфически повышает уровень экспрессии генов-мишеней данного регулона (Demple, 1996; Hidalgo et aL, 1998). В неокисленной форме SoxR может связываться с ДНК, но не способен активировать транскрипцию soxS (Hidalgo et aL, 1997). Помимо супероксидного радикала, активность SoxRS регулона адаптации к окислительному стрессу возрастает под действием перекиси водорода (Manchado et aL, 2000) и оксида азота (NO) (Demple, 1999,b).
По данным литературы в условиях супероксидного стресса ДНК-связывающие транскрипционные факторы SoxR: и SoxS активируют продукцию около 12 белков, таких как супероксиддисмутаза (sodA), эндонуклеаза IV («/о), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (zwf), фумаратредуктаза (fumC), NADH-ферредоксиноксидоредуктаза ifjpr) (Greenberg et aL, 1990; Hidalgo et aL, 1996).
Регул он защиты от пероксидного стресса Escherichia colt находится под контролем OxyR транскрипционного регулятора, имеющего тетрамерную структуру (Hidalgo et aL, 1996). При появлении окисляющих сигналов в присутствии перекиси водорода окисляются два остатка цистеина белка-регулятора (Cys 199 и Cys 208) (Killik et aL, 1995). Образование внутримолекулярной дисульфидной связи между этими остатками приводит к активации белка, который, связываясь с ДНК, вносит конформационные изменения в область промотора, в результате чего становится возможной быстрая транскрипция при участии ст -РНК-полимеразы (Toledano et єй., 1994; Choi et о/., 2001).
Активация OxyR носит временный характер. Реактивируется белок восстановлением окисленных остатков цистеина с помощью фермента глутатионредуктазы за счет глутатиона (Storz, Imlay, 1999; Zeng et aL, 1998; Aslund, 1999). Так как экспрессия глутатионредуктазы находится под контролем OxyR, то можно говорить о том, что ген oxyR отрицательно регулирует собственную экспрессию (Storz et ah, 1990; Tao et al.y 1993).
Согласно данным литературы белок OxyR активирует транскрипцию по меньшей мере 9 белков, среди которых гидропероксидаза HPI (каталаза katG), алкилгидропероксидредуктаза (ahpCF), глутатионредуктаза (gorA), неспецифический ДНК-связывающий белок (dps) и др, (Zheng et ai.t 2001; Altuvia etal., 1997).
Во время голодания или вступления клеток Е. соїі в стационарную фазу индукция адаптивного ответа осуществляется под контролем продукта гена rpoS, представляющего собой а38-субъединицу РНК-полимеразы (as) (Eisenstark et al.y 1996; Jenkins et a/., 1990). В экспоненциальной фазе роста его количество в клетке чрезвычайно мало, однако при вступлении в стационарную фазу внутриклеточный уровень RpoS достигает 30%-50% от уровня вегетативной субъединицы РНК-полимеразы. Установлено, что уровень rpoS м-РНК в клетке сохраняется на достаточно высоком уровне на всех стадиях роста» таким образом, возрастание концентрации белка RpoS объясняется, прежде всего, действием посттранскрипционных механизмов регуляции его содержания в клетке (Jishage, 1996). Однако показано, что транскрипционная регуляция rpoS все же имеет место. При вступлении в стационарную фазу происходит приблизительно 5-10 кратная активация транскрипции. (Hengge-Aronis, 2002а).
Возрастание скорости трансляции rpoS характерно для поздней экспоненциальной фазы, когда растущая культура достигает определенной плотности, а также для ряда стрессовых состояний (низкие температуры, голодание, окислительный стресс). Регуляция скорости трансляции происходит за счет изменения вторичной структуры rpoS м-РНК благодаря чему облегчается или затрудняется инициация трансляции. Отмечено влияние на процесс трансляции нуклеоид-связывающих белков (HU, Hfq и H-NS), малых регуляторных dsrA-PHK. и oxyS-PHK, а также некоторых других регуляторных факторов (LeuO) (Loewen et ah, 1998). Гистоноподобный белок H-NS, связываясь с ДНК, стабилизирует вторичную структуру и препятствует синтезу RpoS, в то время как Hfq способствует нарушению вторичной структуры, дестабилизируя комплекс H-NS-мРНК и способствует инициации трансляции. Малая регуляторная cfcr -PHK, синтез которой репрессируется белком LeuO, взаимодействуя с H-NS, препятствует его связыванию с м-РНК. После вхождения культуры в стационарную фазу уровень трансляции rpoS уменьшается вновь, и последующее возрастание количества JS в клетке происходит благодаря ингибированию деградации белка (Ishihama, 2000; Hengge-Aronis, 2002а).
Влияние окислительного стресса на экспрессию гена oxyR
Колебательный характер активности ферментов связан с накоплением в клетке полиаминов, конечных продуктов ферментативной реакции, участвующих в регуляции по типу обратной связи (Kashiwagi, Igarashi, 1988). Это хорошо иллюстрируется при сопоставлении; активности лизиндекарбоксилазы и внутриклеточного пула кадаверина (рис. I). Следовательно, одной из первичных реакций Е. coli на окислительный стресс является возрастание активности ферментов синтеза и, как следствие -интенсивное образование полиаминов.
Существенная степень индукции системы синтеза, полиаминов свидетельствует о вовлеченности этих соединений в стрессовый ответ, что послужило основанием для дальнейшего изучения роли полиаминов в адаптации к окислительному стрессу.
У Е. coli гены защиты от перекиси водорода входят в состав oxyR регулона. Из 30-40 белков, индуцируемых при воздействии Н2С 2 на клетки этого микроорганизма, 8 являются продуктами генов oxyR регулона (Storz, Imlay, 1999).
Исследование уровня экспрессии oxyR проводили в экспоненциально растущей культуре Е. coli BGF930. Этот штамм несет однокопийное транскрипционное слияние промоторной области гена oxyR с беспромоторной частью структурного гена lacZ, введенное в хромосомную ДНК с помощью бактериофага X. Этот штамм также имеет делецию в хромосоме в области /дс-оперона ив отсутствие /acZ-слияния является дефицитным по р-галактозидазе. Это давало возможность определения уровня экспрессии исследуемого гена путем измерения величины активности р-галактозидазы методом Миллера. добавок перекиси водорода рост этого микроорганизма на синтетической среде с глюкозой сопровождался постепенным снижением уровня экспрессии oxyR. Остановка роста в период исчерпания глюкозы не оказывала существенного влияния на характер кривой (рис. 2, кривая 5).
Добавка 3 мМ перекиси водорода в питательную среду вызывала значительное возрастание активности oxyR. Уровень экспрессии исследуемого гена достигал максимальных значений за 30-40 минут до исчерпания глюкозы и прекращения, вследствие этого, роста культуры (рис. 2, кривая 2). В этом случае отмечались двухфазные изменения уровня экспрессии oxyR с приблизительно равной длительностью фаз его снижения и возрастания, которая составляла около 2 часов. Максимальная степень экспрессии предшествовала возрастанию скорости роста Е. colU ингибированной перекисью, что, по-видимому, свидетельствует о достижении клетками состояния адаптации. Подтверждением этому является также более быстрый подъем скорости роста, после внесения глюкозы в одну из голодающих, стрессированных культур (рис. 2, кривая 3).. За пиком активности р-галактозидазы следовало её постепенное снижение, характер которого не претерпевал каких-либо изменений ни в случае повторного внесения глюкозы, ни в случае продолжающегося голодания. окислительный стресс в значительной степени определяется соотношением концентрации Н2О2 и величины биомассы (рис. 3). Одна и та же концентрация пероксида водорода вызывала в культурах относительно высокой плотности (OD6oo=l) ярко выраженное возрастание Р-галактозидазной активности, в культурах средней плотности (OD6oo=0,2) — слабое возрастание, а в культурах с низкой плотностью (OD60o=0,l) оказывала ингибирующий эффект на уровень активности oxyR.
На основании экспериментальных данных, описанных в настоящем разделе главы можно сделать следующие выводы: 1) активность гена oxyR в отсутствие перекиси водорода при культивировании Е. соН на глюкозо-минеральной среде постепенно снижается; 2) окислительный стресс индуцирует двуфазные изменения уровня экспрессии oxyR, когда в первой фазе происходит снижение активности гена, а во второй — ее подъем; 3) величина воздействия перекиси водорода на экспрессию oxyR зависит от плотности культуры.
На примере некоторых генов эукариотических организмов ранее показано, что полиамины могут оказывать влияние на их промоторную активность. В частности это касается генов, играющих роль в злокачественном перерождении клетки (Bryansk я/., 1996). Существуют также сведения о возможной роли этих соединений в защите эукариотических клеток от воздействия активных форм кислорода и продуктов радиолиза (На et al., 1998; Chiu et a/., 1997). Эти данные в сочетании с результатами, свидетельствующими о возрастании активности ферментов системы синтеза полиаминов под действием перекиси водорода, послужили основанием для исследования эффекта основного полиамина Е. coli путресцина на активность гена oxyR в условиях окислительного стресса.
Роль полиаминов в регуляции топологии ДНК в условиях, окислительного стресса
Установлено, что добавка ДАП к экспоненциально растущей культуре Е. соН в условиях окислительного стресса вызывет снижение максимального уровня экспрессии oxyR приблизительно на 75%. В этом случае присутствие в среде 5 мМ путресцина приводило к 60%-ному восстановлению уровня экспрессии (рис. 10).
В качестве альтернативного пути доказательства роли полиаминов как транкрипционных модуляторов мы использовали генетический подход. С этой целью дефицитный по полиаминам мутантный штамм К coli TI60 с делецией по /ас-оперону использовали для конструирования двух штаммов, несущих oxyR::lacZ и katG::lacZ слияния, путем их трансформации плазмидами pAQ23 и pAQ24 соответственно. В культурах полученных полиаминзависимых мутантов E.coli BEOlOl и ВЕ0102 измеряли активность р-галактозидазы. Таблица Установлено, что уровень индукции oxyRw katG при окислительном стрессе в штаммах, зависимых по полиаминам, был значительно ниже, чем в родительских полиаминнезависимых штаммах. В этих условиях добавка в среду путресцина в значительно большей степени стимулировала генную экспрессию полиаминзависимых штаммов, чем штаммов с ненарушенным синтезом полиаминов (табл. 2).
Данные,, представленные в настоящем разделе главы позволяют сделать следующие выводы: 1) присутствие в среде ингибиторов орнитиндекарбоксилазы вызывает снижение активности гена oxyR при окислительном стрессе; 2) в этих условиях путресцин не только снимает эффект ингибирования, но и проявляет заметное стимулирующее действие в отношении oxyR; 3) уровень экспрессии генов oxyR и katG у дефицитных по полиаминам штаммов значительно снижен по сравнению с аналогичными штаммами с ненарушенным синтезом полиаминов; 4) стимулирующий эффект путресцина на экспрессию генов oxyR и katG значительно сильнее проявляется в отношении полиаминзависимых мутантов по сравнению с интактными родительскими штаммами.
Таким образом, увеличение активности ферментов системы синтеза полиаминов свидетельствует о вовлеченности этих соединений в стрессовый ответ. Путресцин под действием перекиси водорода оказывает стимулирующий эффект на активность oxyR, величина которого зависит от силы стрессового воздействия. Ингибиторы орнитиндекарбоксилазы снижают уровень экспрессии гена oxyR при окислительном стрессе, тогда как путресцин снимает ингибирующий эффект и оказывает стимулирующее действие в отношении oxyR. В условиях окислительного стресса путресцин повышает уровень экспрессии katG, гена-мишени oxyR регулона. Помимо путресцина, стимулирующее действие на активность oxyR оказывает спермидин. Пониженный уровень экспрессии генов oxyR и katG у дефицитных по полиаминам штаммов и значительный стимулирующий эффект путресцина в этом случае, по сравнению с аналогичными штаммами с ненарушенным синтезом полиаминов, свидетельствует о регуляторном влиянии этих соединений на транскрипцию адаптивных генов. ГЛАВА 4. Влияние путресцина на экспрессию адаптивных генов через изменение топологии ДНК
Топология; ДНК является одним из основных параметров, определяющих скорость транскрипционных процессов в клетке (Demple, 1996). Вместе с тем, до настоящего времени практически отсутствовали данные о регуляторном влиянии топологических изменений, ДНК на экспрессию генов адаптации к окислительному стрессу, в частности oxyR, обеспечивающему защиту микроорганизмов от перекиси водорода. Топологическое состояние ДНК определяется такими факторами, как активность ферментов системы топологического гомеостаза (топоизомеразы), концентрация ионов в клетке, взаимодействие с ДНК-связывающими белками и другими. По мнению некоторых авторов полиамины, как поликатионы, также могут оказывать влияние на структуру ДНК. (Bloomfield, 1996, Ткаченко и др., 1997; 1998). Это послужило основанием для исследования возможного влияния полиаминов на топологию ДНК и зависимости от этого параметра уровня экспрессии адаптивных генов в условиях окислительного стресса.
С целью проверки топологической активности путресцина клетки Е. coli BGF930, трансформированные плазмидой pBR322, культивировали в среде М9, содержащей различные концентрации данного поликатиона. В полученной культуре исследовали степень суперспирализации выделенной из клеток плазмидной ДНК. Эксперименты показали, что по мере увеличения концентрации путресцина происходит пропорциональный сдвиг количественного распределения топоизомеров плазмидной ДНК. Как видно из рисунка 11 смещение происходило в сторону более высокого среднего значения Lk. Это свидетельствует о том, что путресцин в концентрациях, близких к физиологическим, вызывает увеличение степени отрицательной суперспирализации ДНК.
Влияние путресцина на частоту мутаций и выживаемость Е, coli при окислительном стрессе
Формирование дыхательных цепей в ходе эволюции с одной стороны дало аэробным организмам энергетические преимущества, с другой - создало проблемы, связанные с образованием токсичных побочных продуктов дыхания. Это привело к развитию систем защиты, действующих как против эндогенных активных форм кислорода, так и АФК присутствующих в среде.
Вовлечение в стрессовый ответ полиаминов как биогенных поликатионов ранее было продемонстрировано на примере теплового, осмотического и других видов стрессовых воздействий (Ткаченко и др. 1997, 1998). Обнаруженное нами в условиях окислительного стресса значительное возрастание активности ключевого фермента синтеза полиаминов, орнитиндекарбоксилазы и лизиндекарбоксилазы, продуктом которой является кадаверин (рис. 1), свидетельствует о том,-что одной из первых реакций Е. coli на присутствие в среде перекиси водорода является возрастание активности ферментов синтеза и, как следствие — интенсивное образование полиаминов.
Процесс адаптации к окислительному стрессу, как и большинству других видов стрессовых воздействий, включает в себя процессы транскрипционной регуляции на уровне регулонов (Demple, 1997). В условиях экспоненциального роста для защиты от пероксидного стресса Е. coli использует систему, находящуюся под контролем oxyR регулона. В состав этого регулона входят гены,, кодирующие такие важные для выживания в условиях окислительного стресса ферменты, как гидропероксидаза I (katG), алкилгидропероксидредуктаза (ahpCF), глутатионредуктаза {gorA) и другие (Storz, Imlay, 1999). Экспрессия этих генов находится под контролем транскрипционного фактора OxyR. Тетрамерный белок OxyR может существовать в двух формах, окисленной и восстановленной, но только окисленная форма активирует транскрипцию. Ранее считалось, что в условиях окислительного стресса не происходит возрастания уровня экспрессии самого oxyR, поскольку его продукт обладает свойствами ауторепрессора (Christman et alt 1989). В то же время есть ряд работ, в которых показана зависимость степени экспрессии oxyR от фазы роста Е. coli и уровня цАМФ в клетке (Gonzalez-Flecha, Demple, 1997; Michan et al., 1999). Это указывает на то, что регуляция экспрессии oxyR играет важную биологическую роль и дает основание предположить возможность участия в этом процессе других механизмов и клеточных регуляторов..
Проведенные нами исследования уровня экспрессии oxyR.. в отсутствие экзогенно добавленной перекиси водорода показали, что в процессе роста Е. coli на синтетической среде с глюкозой, равно как и во время его остановки в период исчерпания глюкозы, отсутствуют двухфазные изменения уровня экспрессии исследуемого гена (рис. 2), описанные для культур, растущих на LB-бульоне (Gonzalez-Flecha, Demple, 1997). Отсутствие выраженного возрастания уровня экспрессии oxyR в условиях роста микробной культуры на среде с глюкозой обусловлено, по-видимому, низкой скоростью эндогенного образования перекиси водорода, вследствие сбраживания части субстрата до конечных продуктов в реакциях "overflow" метаболизма (Xu et al, 1999). Сходный эффект был описан также в ответ на добавку глюкозы в бульонную культуру Е. coli (Gonzalez-Flecha, Demple, 1997).
Рост . coli в присутствии экзогенной Н2О2 на среде М9 с глюкозой (рис. 2), как показали наши эксперименты, характеризовался двухфазными изменениями уровня экспрессии oxyR, подобно бульонным культурам в отсутствие перекиси водорода (Gonzalez-Flecha, Demple, 1997). Снижение уровня экспрессии oxyR в первой фазе по-видимому является результатом адаптации клеток к свежей среде с глюкозой после пересева из инокулята, выращиваемого в течение 16 часов, где к моменту пересева; культура находилась в стационарной фазе. В этих условиях повышение содержания растворенного кислорода в среде, в результате снижения его потребления клетками, приводит к развитию эндогенного окислительного стресса. В сочетании с отсутствием в среде глюкозы и увеличением содержания белка RpoS в клетках в стационатной фазе это приводит к возрастанию уровня активности шгуЯ» что согласуется с данными литературы (Gonzalez-FIecha, Demple, 1997). Следующее за снижением значительное возрастание уровня экспрессии исследуемого гена достигало максимальных значений незадолго до исчерпания глюкозы (рис. 2). По времени это приблизительно соответствует достижению максимального уровня цАМФ в лимитированных глюкозой периодических культурах Е. coll (Ferenci, 1999) и согласуется с данными о подавляющем эффекте глюкозы на уровень экспрессии oxyR (Gonzalez-FIecha, Demple, 1997). Двухфазный характер изменения уровня экспрессии oxyR в условиях окислительного стресса в экспоненциально растущей и голодающей культурах, а также при повторном внесении глюкозы в голодающую культуру (рис. 2) подтверждает данные о регуляторной роли цАМФ для oxyR; (Gonzalez-FIecha, Demple, 1997). Как: известно, эффективное связывание РНК-полимеразы с промотором в оперонах,, подвергнутых катаболитной репрессии, требует присутствия катаболитного цАМФ-связывающего белка (CAP) (Crasnier, 1996; Stiilke, 1999; Saier, 1998). При наличии в среде быстрометаболизируемых субстратов, таких как глюкоза, внутриклеточный пул цАМФ является низким. САР-белок в этих условиях не способен связываться с промоторной областью, и транскрипция структурных генов прекращается (Matin, 1996; Blum, 1990; Busby et ah, 1999). В период исчерпания глюкозы происходит увеличение содержания цАМФ в клетке, что по-видимому стимулирует связывание РНК-полимеразы с промотором гена oxyR.
Показано, что одним из факторов, которые также могут оказывать влияние на силу белок-нуклеиновых взаимодействий являются полиамины (Thomas, Thomas, 2001). Аминогруппы этих биогенных поликатионов при физиологических значениях рН являются протонированными. Количество аминогрупп и расстояние между ними варьируют в зависимости от длины углеродной цепи в молекулах различных полиаминов, что определяет специфичность их взаимодействия с отрицательно заряженными группами таких макромолекулярных компонентов клетки, как фосфолипиды и нуклеиновые кислоты (Tabor, Tabor, 1985). Результатом таких взаимодействий является влияние, которое оказывают полиамины на многие клеточные процессы. В частности известно, что путресцин способен вытеснять /йс-реперессор из связанного с ДНК состояния (Сарр et al.t 1996). Это обусловлено тем, что в молекуле данного диамина положительные заряды расположены на расстоянии, обеспечивающем оптимальное взаимодействие с полианионными цепями ДНК (Bloomfield, Wilson, 1987).
