Введение к работе
Актуальность проблемы Одним из основных критериев качества жизни населения считается уровень инфекционной заболеваемости Важнейшей проблемой здравоохранения, приобретающей все большую социально-экономическую значимость, является внутрибольничное инфицирование
В России проблема борьбы с внутрибольничными инфекциями (ВБИ) относится к числу приоритетных Несмотря на проведение регламентированных санитарно-эпидемиологических мероприятий и успехи в антимикробной терапии, частота нозокомиальных инфекций в структуре патологии не только не уменьшается, но и проявляет тенденцию к нарастанию (Малеев В В , 2004, Зуева Л П, 2000, Решение коллегии МЗ РФ, 2002, Покровский В И с соавт , 2001) Среди причин, влияющих на уровень заболеваемости ВБИ и их структуру, указывают возрастание числа лиц с измененным иммунным статусом в России приблизительно 40 % взрослого населения имеют различные иммунопатологические состояния Существенное влияние на динамичный рост нозо-комиального инфицирования оказывают регистрируемое повсеместно старение населения, ухудшение экологической обстановки, увеличение перечня заболеваний и агентов, приводящих к иммуносупрессии (Покровский ВИ с соавт, 2001)
Одним из основных этиологических агентов госпитальной инфекции с высокими показателями заболеваемости и летальности является синегнойная палочка (Wenzel RP, 1990) Внешняя среда хирургических, урологических, ожоговых, реанимационных отделений является основным источником инфицирования пациентов Pseudomonas aeruginosa Известно, что этот микроорганизм способен к резервации в объектах окружающей среды в течение длительного времени Циркуляция Р aeruginosa в среде стационаров создает потенциальную опасность возникновения ВБИ среди пациентов с компрометированной иммунной системой на фоне основного заболевания, стресса или иммуно-супрессивной терапии По данным А Ф Мороз с соавторами, синегнойная палочка является причиной госпитальных инфекций в 20-30 % регистрируемых случаев (Мороз А Ф с соавт , 1988)
Антибактериальная терапия при синегнойной инфекции недостаточно эффективна вследствие естественной множественной антибиотикорезистент-ности микроорганизма, а также вследствие увеличения числа резистентных штаммов Р aeruginosa на фоне нерациональной терапии Активная иммунизация может быть успешна при синегнойной инфекции при наличии низко токсичных вакцинных препаратов, выборе оптимальных режимов вакцинации, способности пациентов к полноценному иммунному ответу В настоящее время синтезированы разнообразные вакцинные препараты для специфической профилактики синегнойной инфекции (Pseudogen, Pioimmunogen, PEV-01 и многие другие), но их применение для тяжелых больных часто оказывается неэффективным из-за невозможности выработки адекватного иммунного ответа (Stanislavsky Е et al, 1998)
Увеличение числа полиантибиотикорезистентных госпитальных штаммов Р aeruginosa, возрастание количества лиц с измененным иммунным стату-
сом, для которых традиционная терапия малоэффективна, а также способность данного патогена к быстрой колонизации макроорганизма показывают необходимость изменения тактики борьбы с синегнойной инфекцией и требуют разработки новых средств профилактики и лечения
С начала 80-х годов XX века появились публикации зарубежных авторов о получении моноклональных антител (МКА) против различных антигенов Р aeruginosa, накоплены данные об эффективности МКА различной эпитоп-ной направленности как средств профилактики и лечения экспериментальной синегнойной инфекции (Hancock R Е W et al, 1982, 1985, Muthana L M , 1983, Sawada Sh et al, 1984, Ye Danni et al, 1985, Rosok M J et al, 1990, Lam J S et al, 1988, De Kievit T R, 1994, Yoshida К, 1989, Bogard W С , 1987, Frank D W , 2-002, Morrison DC et al, 1990, Nelson J W et al, 1992, El-Zaim D E et al, 1998, Lang А В et al, 1989, Braderer U et al, 1993, Kurryama M , 1990)
В нашей стране такие исследования не проводили ввиду отсутствия отечественных коллекций гибридом-продуцентов МКА против антигенов Р aeruginosa В настоящее время в Волгоградском НИПЧИ создан набор гибридных клонов, продуцирующих мышиные МКА к белкам наружной мембраны, липополисахариду (ЛИС), экзотоксину А (ЭТА) Р aeruginosa (Карпова М В с соавт, 2000, Храпова Н П с соавт, 2000, 2002, Ломтатидзе М В с соавт, 2004)
Изучение протективных свойств МКА различной антигенной направленности позволит выявить наиболее перспективные варианты антител для профилактики и лечения синегнойной инфекции
Цель работы, - изучение протективных свойств моноклональных антител против различных антигенов Pseudomonas aeruginosa на модели мышиного экспериментального синегнойного сепсиса
Задачи исследования
моделирование экспериментального синегнойного сепсиса,
получение МКА против эпитопов ЭТА Р aeruginosa,
накопление m vitro и in vivo МКА против различных антигенов Р aeruginosa,
оптимизация режимов парентерального введения МКА для профилактики и лечения экспериментальной синегнойной инфекции,
анализ эффективности применения МКА и смесей МКА различной эпитопной направленности, а также сочетаний МКА и антибиотика для профилактики и лечения синегнойной инфекции в эксперименте,
изучение возможности приготовления липосомальных форм МКА и оценка эффективности их применения для профилактики и лечения экспериментальной синегнойной инфекции
Научная новизна
Получены новые данные о роли гуморальных антител в защите макроорганизма от синегнойной инфекции Впервые изучен протективный потенциал моноклональных иммуноглобулинов против различных антигенов Р aeruginosa, представлены доказательства эффективности пассивной защиты биомоделей от экспериментальной синегнойной инфекции
Определены варианты МКА различной эпитопной направленности, обладающие высоким протективным потенциалом при использовании в различных режимах применения с целью создания пассивного иммунитета у экспериментальных животных при синегнойном сепсисе
Впервые в нашей стране получены гибридные клоны, продуцирующие мышиные моноклональные антитела против экзотоксина А Р aeruginosa, определены особенности получения иммунных В-лимфоцитов мышей, выбора партнеров при гибридизации клеточных линий Представлены приоритетные данные об условиях выделения и накопления экзотоксина А Р aeruginosa, оценке его биологической активности in vivo и in vitro Оптимизированы схемы антигенной стимуляции мышей-доноров спленоцитов, используемых при гибридизации клеточных линий с целью получения МКА против эпитопов ЭТА
Впервые изучен протективный потенциал МКА, включенных в липо-сомы, оптимизированы схемы комбинированного использования моноклональных иммуноглобулинов и гентамицина сульфата, включенного в липосо-мы, для профилактики и лечения экспериментальной синегнойной инфекции
Полученные данные позволяют говорить о прототипах МКА, которые в перспективе могут быть рекомендованы для клинического применения как средства иммунопрофилактики и иммунотерапии синегнойной инфекции
Практическая ценность
Получены гибридные клоны-продуценты мышиных МКА против эпитопов экзотоксина А Р aeruginosa, обладающие высоким протективным потенциалом Гибридомы постоянно хранятся в жидком азоте в биохранилище Волгоградского НИПЧИ, что реализует возможность накопления моноклональных иммуноглобулинов в любое время Оптимизированы условия культивирования токсигенного штамма Р aeruginosa на этапе приготовления препаративных количеств экзотоксина А Показано преимущество использования теста цитотоксичности экзотоксина А на перевиваемых клеточных линиях in vitro с целью определения предельно допустимых суммарных антигенных нагрузок для животных при иммунизации мышей как этапа гибридомной технологии Особенности условий гибридизации клеточных линий изложены в «Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов моноклональных антител к липополисахариду и экзотоксину А синегнойной палочки» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 05 06 2002 г , протокол № 6 и утверждены директором института)
Подтверждены данные зарубежных исследований (Barclay GR et al, 1986) об отсутствии отчетливой взаимосвязи протективного эффекта МКА и активности антител (AT) в ТИФМ, изотипа AT, концентрации, взаимодействия МКА и ферментов протеазы и фосфолипазы С Р aeruginosa Условия оценки антиферментной активности МКА определены в «Методических рекомендациях по определению влияния моноклональных антител на ферменты синег-нойной палочки» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 05 06 2002 г, протокол №6 и утверждены директором института)
Оптимизированы режимы парентерального введения МКА против различных антигенов синегнойной палочки для профилактики и лечения экспериментального синегнойного сепсиса Конкретизированные схемы применения препаратов иммуноглобулинов, сочетаний МКА и антибиотика представлены в «Методических рекомендациях по оценке протективности моноклональных антител против антигенов Pseudomonas aeruginosa на модели синег-нойнОго сепсиса в эксперименте» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 05 06 2002 г, протокол №6 и утверждены директором института)
Определены типы МКА, обладающие наибольшей протективной активностью, проведено сравнительное исследование протективного эффекта МКА и сочетаний МКА с антибактериальным препаратом (гентамицина сульфат, включенный в липосомы) Показаны отдельные преимущества различных препаратов в зависимости от режима применения
Материалы диссертационной работы включены в цикл лекций по диагностике, лечению и профилактике особо опасных инфекций на курсах подготовки специалистов «Курсы первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям» при ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Полученные данные представляют интерес для сотрудников иммунологических лабораторий, занимающихся вопросами защиты от патогенных микроорганизмов и разработкой средств серотерапии и серопрофилактики инфекционных заболеваний
Основные положения, выносимые на защиту
Применение МКА различной эпитопной направленности защищает экспериментальных мышей от острой синегнойной инфекции, увеличивая выживаемость животных в ряде случаев до 83 % МКА против эпитопов экзотоксина А Р aeruginosa обладают более выраженной протективной активностью, чем МКА против эпитопов ЛПС, полисахарида (ПС) в составе ЛПС Использованные в работе МКА против эпитопов белков наружной мембраны синегнойной палочки не обладают протективной активностью
Оптимальными условиями получения экзотоксина А Р aeruginosa 103Р являются культивирование глубинным способом при температуре 32 С в среде на основе диализата триптического перевара соевых бобов, обогащен-
ной глютаматом натрия и глицерином с предварительной абсорбцией ионов железа
3 Проведение эффективной гибридизации клеточных линий и полу
чение гибридом-продуцентов МКА против эпитопов ЭТА Р aeruginosa 103Р
были обеспечены стимуляцией мышей-доноров В-лимфоцитов препаратом эк
зотоксина А в минимальных дозах при непродолжительных циклах иммуни
зации, а также использованием линии мышиных миеломных клеток Sp2/0
Оптимальным режимом применения препаратов МКА для защиты биомоделей от экспериментальной синегнойной инфекции является профилактический Сочетанное применение моноклональных иммуноглобулинов и антибиотика гентамицина сульфата в липосомальной форме более эффективно на ранних этапах лечения
Применение липосомальных форм смесей МКА против эпитопов экзотоксина А Р aeruginosa является перспективным направлением исследований в рамках защиты от синегнойной инфекции
Объем и структура диссертации
![Использование липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения раневой инфекции в эксперименте [Электронный ресурс]](/i/i/4326/211478.png "Использование липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения раневой инфекции в эксперименте [Электронный ресурс] Снатенков Евгений Александрович")