Симбиотические взаимоотношения лактобацилл и микроорганизмов желудочно-кишечного тракта Червинец, Юлия Вячеславовна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 14

1.1. Микробные экосистемы макроорганизма 14

1.2. Понятие симбиоза 17

1.3. Классификация и распространённость лактобацилл 19

1.4. Взаимосвязь лактобацилл и макроорганизма 21

1.4.1. Положительные эффекты лактобацилл на организм человека 21

1.4.2. Основные механизмы воздействия лактобацилл 22

1.4.3. Адаптационные и пробиотические факторы лактобацилл 22

1.5. Межмикробное взаимодействие лактобацилл (пробиотический фактор) 23

1.5.1. Конкуренция и сотрудничество за питательные вещества 23

1.5.2. Конкурентное исключение 24

1.5.3. Продукция кислот 26

1.5.4. Продукция бактериоцинов 27

1.5.5. Продукция перекиси водорода (Н202) 33

1.5.6. Бактериальная межклеточная взаимосвязь 34

1.6. Воздействие на кишечный эпителий (пробиотический фактор) 35

1.7. Влияние на иммунитет (пробиотический фактор) 38

1.8. Адгезивные свойства лактобацилл 40

1.9. Конкуренция бактерий in vitro 44

1.10. Демонстрация антимикробной активности лактобацилл на моделях животных 46

1.10.1. Адгезивные свойства и персистенция в кишечнике 46

1.10.2. Активность по отношению к Н. Pylory 47

1.10.3. Активность по отношению к микроорганизмам рода Salmonella 47

1.10.4. Активность по отношению к Escherichia coli 47

1.10.5. Активность по отношению к Listeria monocytogenes 48

1.10.6. Активность по отношению кротавирусам 48

1.10.7. Активность по отношению к P. Aeruginosa 48

1.11. Влияние пробиотиков на поддержание здоровья и течение заболевания 49

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 57

2.1. Материал 57

2.1.1. Штаммы микроорганизмов 57

2.1.2. Питательные среды 59

2.2. Методы исследования 60

2.2.1. Выделение чистой культуры микроорганизмов 60

2.2.2. Биохимическая идентификация чистой культуры микроорганизмов...62

2.2.3. Генетическая идентификация чистой культуры микроорганизмов 70

2.2.4. Определение антагонистической способности лактобацилл методом перпендикулярных штрихов 73

2.2.5. Определения кислотопродуцирующей способности лактобацилл 73

2.2.6. Определение факторов патогенности лактобацилл 74

2.2.7. Определение адгезивной способности лактобацилл 77

2.2.8. Определение аутоагрегации лактобацилл 78

2. 2.9. Определение поверхностной гидрофобности лактобацилл 78

2.2.10. Определение способности лактобацилл к 78

2.2.11. Определение способности лактобацилл формировать биоплёнки 79

2.2.12. Отношение лактобацилл к антимикробным препаратам 79

2.2.13. Определение чувствительности лактобацилл к химиопрепаратам ихитозану 80

2.2.14. Определение экзометаболитов лактобацилл 80

2.2.15. Определение антагонистической способности лактобацилл методом двухслойного агара или отсроченного антагонизма (продукция бактериоцинов) 90

2.2.16. Определение антимикробной активности супернатантов, содержащих бактериоциноподобные вещества 90

2.2.17. Совместное культивирование на поверхности плотной питательной среды 91

2.2.18. Определение антивирусной активности лактобацилл 92

2.2.19. Антагонистическая активность лактобацилл в эксперименте на животных in vivo 93

2.2.20. Статистические методы обработки материалов исследований 94

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований Выделение, идентификация и отбор представителей нормобиоценоза, патогенной и условно-патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта 95

3.1. Культуральные свойства микроорганизмов желудочно-кишечного тракта человека 95

3.2. Морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов желудочно-кишечного тракта человека 99

3.3. Биохимические свойства микроорганизмов желудочно-кишечного тракта человека 101

3.4. Факторы патогенности условно-патогенной и патогенной микрофлоры 104

ГЛАВА 4. Выделение, идентификация и отбор антагонистически активных штаммов лактобацилл 109

4.1. Изучение культурально-морфологических свойств лактобацилл 109

4.2. Факторы патогенности лактобацилл 110

4.3. Отношение лактобацилл к антибактериальным препаратам 110

4.4. Антагонистические свойства лактобацилл 112

4.5. Биохимическая идентификация лактобацилл 113

4.6. Генетическая идентификация лактобацилл 118

ГЛАВА 5. Симбиоз лактобацилл с микробиотой человека 122

5.1. Симбиоз лактобацилл с нормофлорой, условно-патогенной и патогенной микрофлорой желудочно-кишечного тракта 122

5.1.1. Симбиоз лактобацилл, выделенных из полости рта 123

5.1.2. Симбиоз лактобацилл, выделенных из желудка 168

5.1.3. Симбиоз лактобацилл, выделенных из кишечника 182

5.1.4. Симбиоз лактобацилл по отношению к грибам 216

5.2. Симбиоз лактобацилл между собой и бифидобактериями 227

5.3. Симбиоз лактобацилл со штаммами вируса полиомиелита 228

ГЛАВА 6. Адаптационный и пробиотический потенциал антагонистически активных штаммов лактобацилл 231

6.1. Адгезивная способность антагонистически активных штаммов лактобацилл 231

6.2. Аутоагрегация антагонистически активных штаммов лактобацилл 232

6.3. Поверхностная гидрофобность антагонистически активных штаммов лактобацилл 233

6.4. Способность антагонистически активных штаммов лактобацилл ккоагрегации 234

6.5. Способность антагонистически активных штаммов лактобацилл формировать биоплёнки 236

6.6. Кислотопродуцирующая способность лактобацилл 240

6.6.1. Кислотопродуцирующая способность лактобацилл, выделенных из полости рта 240

6.6.2. Кислотопродуцирующая способность лактобацилл, выделенных из желудка 243

6.6.3. Кислотопродуцирующая способность лактобацилл, выделенных из кишечника 245

6.7. Определение экзометаболитов лактобацилл 248

6.7.1. Хромато-масс-спектрометрия на системе «Dionex UltiMate3000- API 2000» 248

6.7.2. Капиллярный электрофорез на системе «Капель-105» 255

6.7.3. Обработка полученных результатов 255

6.7.4. Получение полипептидных фракций, содержащих бактерицины 256

6.8. Определение антагонистической активности полипептидных фракций лактобацилл 257

6.8.1. Определение антагонистической активности полипептидных фракций лактобацилл в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов 257

6.8.2. Определение антагонистической активности полипептидных фракций лактобацилл в отношении представителей нормальной микрофлоры человека 258

6.8.3. Определение антагонистической активности супернатанта бульонной культуры L. acidophilus (helveticus ТШ) NK1 и их полипептидов 259

6.8.4. Определение антагонистической активности супернатанта бульонной культуры Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 и их полипептидов 262

6.9. Определение генов, ответственных за синтез бактериоцинов 265

6.10. Антагонистическая активность лактобацилл в эксперименте на животных in vivo 267

ГЛАВА 7. Обсуждение 276

Выводы 301

Практические рекомендации 303

Список работ, опубликованных по теме работы 304

Приложения 345

• Воздействие на кишечный эпителий (пробиотический фактор)
• Генетическая идентификация чистой культуры микроорганизмов
• Морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов желудочно-кишечного тракта человека
• Способность антагонистически активных штаммов лактобацилл формировать биоплёнки

Введение к работе

Актуальность проблемы

Воспалительные и эрозивно-язвенные поражения желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) занимают одно из первых мест во всем мире (Ряпис Л.А., 2012). Большинство этих болезней протекают на фоне дисбиоза пищевода, желудка, 12-перстной кишки, тонкого и толстого кишечника (Бондаренко В.М., 2007; Иванова Т.Н., 2007). В настоящее время для коррекции нарушенного микробиоценоза (дисбактериоза, дисбиоза) применяют препараты-пробиотики, проявляющие свой лечебный и профилактический эффекты через регуляцию нормальной микрофлоры организма хозяина (Нилова Л.Ю., 2008; Амерханова, А.М., 2009; Алешкин А.В., 2011; Давыдкин В.Ю., 2011; Митрохин С.Д., 2008, Sirilun S., 2010). Наиболее распространенным подходом в терапии дисбиоза является "метод вытеснения", основанный на применении больших доз лечебных антибактериальных препаратов. Клинико-экспериментальные работы по бактериотерапии дисбактериозов показали, что лучший эффект достигается при индивидуальном подборе донорских штаммов, либо при использовании аутофлоры (Ермоленко Е.И., 2009). Разрабатываемые новые штаммы микроорганизмов из ЖКТ здоровых людей должны расширить и улучшить функциональные характеристики выпускаемых в настоящее время препаратов-пробиотиков для профилактики и лечения социально-значимых заболеваний, сопровождающихся дисбиозом ЖКТ (Жиленкова О.Г., 2011).

Коммерциализация новых пробиотиков составляет от 2 до 23%, однако анализ данных свидетельствует о новизне получаемых исследователями результатов, которые сопоставимы с долей получаемых прав на интеллектуальную собственность. Практически все получаемые научные результаты по выделению новых штаммов пробиотиков обладают новизной и рассматриваются как перспективный коммерческий продукт. Несмотря на то, что указанные микроорганизмы используются в качестве пробиотиков, их биосовместимость с другими пробиотическими препаратами, чувствительность к антимикробным химиотерапевтическим препаратам оставляют желать лучшего. Исходя из анализа данных отечественных и зарубежный исследований можно сделать вывод, что доля интеллектуальной и прикладной продукции новых пробиотиков будет увеличиваться (Корниенко Е.А., 2007, Парфенов А.И., 2009, Чернин В.В., 2011, Sadaf A., 2009, Stamatova I.V.,2010). Создание, изучение и испытание относительно дешевых пробиотических препаратов представляется крайне перспективным и экономически выгодным направлением для профилактики и терапии социально значимых заболеваний.

Показано, что организм взрослого человека состоит примерно из 10¹³ клеток, в то время как в органах, тканях, а также в полостях человека обитает до 10¹⁴-10¹⁵, а при некоторых патологических состояниях – до 10¹⁷ клеток микроорганизмов (Шендеров Б.А., 2003,2005). Микробиота (совокупность микроорганизмов) человека активно участвует в жизнедеятельности человека (пищеварительном процессе, обмене веществ, поддержании иммунного статуса). Несмотря на обилие информации, на данный момент нет точных данных, описывающих качественные и количественные симбиотические взаимоотношения между представителями нормофлоры (лактобацилами), а также условно-патогенными и патогенными микроорганизмами ЖКТ.

Микробиота человека интенсивно изучается (). В рамках Human Microbiome Project определена полная нуклеотидная последовательность и аннотированы геномы 20 штаммов 14 видов лактобацилл. Работа по определению полной нуклеотидной последовательности генома еще 54 штаммов 22 видов лактобацилл ведется, но еще не завершена (). Последние научные данные указывают на специфичность видового состава кишечной микрофлоры, как у каждого индивидуума, так и у национальных и региональных групп населения. Такие исследования проводятся и в Институте общей генетики им Н.И. Вавилова РАН (, ).

Наиболее перспективными препаратами пробиотиками являются лактобациллы, представители нормальной микрофлоры, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, способные синтезировать ряд антибиотикоподобных веществ, таких как органические кислоты (молочную кислоту), перекись водорода, мурамидазу, бактериоцины, микроцины (Бондаренко В.М., 2010). Симбиоз лактобацилл с микроорганизмами осуществляется при формировании единой генетической системы, биоплёнки, определяющей пищевые, энергетические и другие связи между собой и внешним миром по типу «QS», «социального поведения микроорганизмов». В связи с этим представляется актуальным изучение механизмов, обеспечивающих симбиотические взаимоотношения лактобацилл с микроорганизмами ЖКТ, а также пробиотическими штаммами. Это позволит выделить наиболее антагонистически активные штаммы лактобацилл, которые можно использовать для создания перспективных пробиотических препаратов.

Цель исследования – выделить антагонистически активные штаммы лактобацилл от здоровых людей, определить их симбиотические взаимоотношения с микроорганизмами пищеварительного тракта, а также пробиотическими штаммами, и установить механизм пробиотического действия лактобацилл.

Задачи исследования

1. Выделить и идентифицировать представителей нормофлоры, патогенной и условно-патогенной микрофлоры пищеварительного тракта от здоровых людей различных возрастных групп, а также больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ.

2. Выделить и идентифицировать лактобациллы из полости рта, желудка, 12 п. кишки и толстого кишечника здоровых людей различных возрастных групп.

3. Отобрать высокоантагонистические штаммы лактобацилл из различных биотопов пищеварительного тракта здоровых людей для создания новых пробиотиков.

4. Определить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с микроорганизмами нормофлоры пищеварительного тракта.

5. Изучить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с представителями патогенной и условно-патогенной микрофлоры пищеварительного тракта.

6. Установить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с пробиотическими штаммами микроорганизмов (лактобацилл, бифидобактерий).

7. Выяснить механизм пробиотического действия лактобацилл.

8. Определить генетические маркеры антагонистической активности лактобацилл.

9. В эксперименте на животных выявить антагонистическую активность лактобацилл в отношении сальмонелл.

Научная новизна

Новизна работы заключается в выделении из пищеварительного тракта здоровых людей новых штаммов лактобацилл, обладающих высокой степенью антагонизма по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чувствительностью к антибактериальным препаратам, биосовместимостью с применяемыми в настоящее время другими препаратами-пробиотиками.

Лактобациллы, выделенные из полости рта здоровых людей, проявили наиболее выраженные антагонистические свойства по отношению к условно-патогенной и патогенной бактериальной и грибковой микрофлоре ЖКТ.

Показано, что механизм формирования пробиотической активности лактобацилл складывается из совместного действия пробиотического и адаптационного потенциала.

Полученные данные о симбиотических взаимоотношениях лактобацилл с микрофлорой пищеварительного тракта в составе биопленок могут быть использованы для создания перспективных пробиотических препаратов, что позволит практическому врачу оптимизировать лечение заболеваний ЖКТ.

Теоретическая значимость

Лактобациллы, выделенные из определенного биотопа, более активно подавляют патогенную и условно-патогенную микрофлору пищеварительного тракта того же локуса.

Генетическими методами исследования подтверждено, что наличие генов, ответственных за синтез бактериоцинов у лактобацилл, в значительной степени обуславливающих проявление антагонистической активности, не всегда коррелирует с бактериоциногенностью бактерий, выявленной культуральным методом.

Получены новые данные, расширяющие теоретические представления о симбиотических взаимодействиях лактобацилл с условно-патогенными и патогенными микроорганизмами, заселяющими пищеварительный тракт человека, начиная с полости рта, заканчивая кишечником. Эти материалы могут лечь в основу изучения механизмов формирования симбиотических отношений между различными родами и видами микроорганизмов.

Практическая значимость

Работа является фрагментом плановой темы НИР кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Тверской государственной медицинской академии, № госрегистрации 01.2.006.06352.

Получены 2 патента РФ на изобретение: № 2235324 от 25 августа 2004 г.: «Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс диагностике дисбактериоза кишечника» и № 2400174 от 27 сентября 2010 г.: «Способ местного лечения воспалительных заболеваний пародонта»; поданы 2 заявки на изобретение: «Штамм бактерий Lactobacillus plantarum 36к ВКПМ В-11154, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам» № 2012105262 от 16.02.2012 и «Штамм бактерий Lactobacillus rhamnosus 38к ВКПМ В-11155, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам» №2012105265 от 16.02.2012.

В государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора депонировано 19 штаммов и 2 штамма лактобацилл депонировано во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Эти штаммы можно использовать для создания перспективных пробиотических препаратов, обладающих широким спектром антимикробной активности и адаптированных к организму человека.

Внедрение в практику

Поданы две заявки о выдачи патента РФ на изобретение в Федеральную службу по интеллектуальной собственности ФГБУ Федерального института промышленной собственности:

1. Штамм бактерий Lactobacillus plantarum 36к ВКПМ В-11154, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Регистрационный номер заявки – 2012105262 от 16.02.2012.

2. Штамм бактерий Lactobacillus rhamnosus 38к ВКПМ В-11155, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Регистрационный номер заявки – 2012105265 от 16.02.2012.

Получены 2 патента РФ на изобретение:

2. 1. № 2235324 от 25 августа 2004 г.: «Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс диагностике дисбактериоза кишечника»;

   2. № 2400174 Бюл.№ 27, 27.09 2010 г.: «Способ местного лечения воспалительных заболеваний пародонта».

   В государственную коллекцию микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора депонировано 19 штаммов.

   Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии, а также в работе бактериологической лаборатории НИЦ ГБОУ ВПО Тверской ГМА Минздравсоцразвития России. Получен акт о внедрении материалов диссертации в учебный процесс и научную работу кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Новосибирского государственного медицинского университета Минздравсоцразвития России.

   Апробация работы

   Результаты исследования доложены: на международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» и IV Международной конференции по иммунотерапии, посвященных 100-летию присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии и 25-летию Всесоюзного научного общества иммунологов, 2009 г. в виде стендового доклада; на V съезде Общества биотехнологов России и Всероссийском совещании работников биотехнологической отрасли промышленности, Москва 2-4 декабря, 2008г. в виде стендового доклада; на XV Международная конференция челюстно-лицевых хирургов и стоматологов «Новые технологии в стоматологии» 17-19 мая 2010г. г. Санкт-Петербург, в виде устного доклада; на межрегиональной научно-практической конференции «Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта», Тверь, 8 апреля, 2011 г. в виде устного доклада; на межрегиональной научно-практической конференция «Актуальные вопросы рефлюкс-эзофагита и язвенной болезни», 20 апреля 2012 г., Тверь, в виде устного доклада.

   Положения, выносимые на защиту

   1. Выделенные и идентифицированные штаммы лактобацилл из различных биотопов пищеварительного тракта здоровых людей обладают выраженным адаптационным потенциалом.

   2. Выделенные штаммы лактобацилл не оказывают взаимного антагонистического воздействия, не подавляют метаболизма и размножения бифидобактерий, а также практически не влияют на рост нормофлоры ЖКТ.

   3. Выделенные штаммы лактобацилл проявляют выраженную антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ, а также вакцинным полиовирусным штаммам Сэбина 1, 2 и 3 типов.

   4. Механизм пробиотического действия выделенных штаммов лактобацилл связан с продукцией молочной кислоты и полипептидных фракций, обладающих избирательным антагонистическим действием по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам.

   5. Выявлена антагонистическая активность лактобацилл в отношении сальмонелл в эксперименте на животных и показана положительная динамика регенерации пораженных органов.

   Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 03.02.03 — «микробиология». Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта микробиологии.

   Личный вклад

   Весь материал диссертации собран, обработан и проанализирован лично автором. Вклад автора является определяющим и в обсуждении результатов исследования в научных публикациях и докладах.

   Публикации

   Основное содержание работы отражено в 53 научных публикациях: в 21 статье, в том числе, в 17 статьях, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

   Объем и структура диссертации

   Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4-х глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы из 397 наименований, в том числе, 270 зарубежных и 127 отечественных работ. Диссертация изложена на 412 страницах основного текста, содержит 134 рисунка, 149 таблиц, 1 схему и 5 приложений.

   Воздействие на кишечный эпителий (пробиотический фактор)

   Бактериальная межклеточная взаимосвязь QS — это хорошо изученный межклеточной механизм, посредством которого лактобациллы продуцируют бактериоцины. Недостаток или избыток того или иного субстрата или метаболита, также как и изменение окружающей среды, служат сигналом для адаптивных или необратимых изменений в соответствующем звене микроэкологической системы [104, 116, 119]. Внутривидовое бактериальное общение у грамположительных бактерий в основном происходит посредством специфических сигнальных пептидов ау-тоиндукторов, которые часто модифицированы и выделяются специализированными транспортными системами [270, 296]. Эти сигнальные молекулы обнаруживаются чувствительными клетками с помощью специализированных 2CRSs- Выявлено наличие пяти сигнальных молекул QS 2CRSs у L. plantarит WCFS1, двух — у кишечных видов L. acidophilus NCFM и L. johnsonii NCC 533, одной — у кишечных видов L. salivarius UCC118 и пищевых видов L. delbrueckii subsp. bulgaricus АТСС ВАА-365, и ни одного у кишечных видов L. gasseri АТСС 33323 [296]. Такое большое количество идентифицированных молекул у L. plantarum WCFS1 может вызывать экологическую трансформируемость этих видов, которые обнаруживаются в растениях, ферментирующихся продуктах питания и в ЖКТ [177]. Другие лактобациллы обладают ограниченными возможностями в окружающем пространстве, возможно из-за небольшого количества QS 2CRSs [296].

   В 1990 г. описано новое семейство сигнальных молекул, аутоиндукто-ров-2 (AI) и сходных с ними synthase LuxS, присутствующих у грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий [373], участвующих в межвидовом общении. У Vibrio harveyi аутоиндуктор-2 (AI-2) является одной из сигнальных молекул, регулирующей процесс биолюминесценции через комплекс фосфорилической системы [231]. Связывание AI-2 с периплазматическим рецептором LuxP регулирует активность чувствительной киназы LuxQ внутренней мембраны, передающей информацию от AI-2 в цитоплазму. Vibrio harveyi может продуцировать свет в ответ на аутоиндукторы-2, вырабатываемые многими другими штаммами бактерий. AI-2 действуют как универсальные сигнальных молекул, стимулирующие межвидовые межклеточные взаимодействия [178]. Используя биолюминисцентный анализ Vibrio harveyi [182], протестировал истощённый супернатант разных культур лактобацилл на предмет наличия сигнальных молекул AI-2. Только некоторые штаммы, такие как L. rhamnosus GG, L. plantarum NCIMB8826, L.johnsonii VPI1088, L. casei ATCC 393, продуцировали AI-2 молекулы [182].

   Бактерии могут использовать сигнальные молекулы QS для взаимодействия с организмом по типу общения между царствами [237]. В это общение вовлечены небольшие молекулы, такие как гормоны, продуцируемые эука-риотами, и гормоноподобные вещества, вырабатываемые бактериями. Показана роль норадреналина, образующегося в организме, и подобной ему ароматической сигнальной молекулы AI-3, продуцируемой комменсальной мик-робиотой: обе сигнальные молекулы могут активировать гены патогенности ЭГКП за счёт индукции 1ег экспрессии [150]. AI-3 имеет ароматическое строение, произошедшее из тирозина, чей биосинтез связан с активацией метилового цикла и метаболизма метионина [392]. Лактобациллы служат препятствием действия сигнальных молекул. Супернатант L. reuteri ATCC 55730 подавлял негативный эффект от экспрессии локуса ler ЭТКП [347]. Подобно L. reuteri, L. acidophilus La-5 также подавлял экспрессию генов патогенносте ЭГКП [327].

   Эпителиальные клетки кишечника являются первой важной мишенью воздействия пробиотичесиких штаммов лактобацилл. Метаболическое взаимодействие между лактобациллами и организмом может регулировать в основном пищевую функцию эпителия. Лактобациллы в ЖКТ вырабатывают молочную кислоту, которая может преобразовываться в масляную кислоту. В свою очередь, масляная кислота является исключительно важным источником энергии клеток СО кишечника, что является необходимым условием для сохранения жизнеспособности кишечного эпителия [324, 349]. Лактобациллы характеризуются способностью усваивать желчные кислоты, основной функцией которых является эмульгирование жиров. Это взаимовыгодное сотрудничество лактобацилл лежит в основе регуляции многих метаболических заболеваний: диабет [147], ожирение [304], рак кишечника [198]. Хотя лактобациллы известны как ауксотрофы по отношению к витаминам группы В, некоторые штаммы лактобацилл, такие как L. reuteri JCM1112, могут синтезировать витамин В9 и/или В]2 [233, 379]. Благодаря лактобациллам происходит эндогенный синтез многих витаминов (никотиновая и фолиевая кислоты, тиамин, биотин, цианкобаламин, витамины К, С, Н), улучшается всасывание витаминов Д и Е, поступивших в организм с пищей [113, 125]. Лактобациллы способны разлагать белки до конечных продуктов распада (индол, фенол, скатол), утилизировать непереваренные пищевые субстраты, образуя органические кислоты, аминокислоты и другие соединения, которые нормализуют обмен веществ в организме [42].

   Изменение функций эпителиального барьера влечет за собой появление большого разнообразия расстройств, включающих в себя кишечные инфекции, пищевую аллергию, аутизм и стресс [385]. Пробиотические лактобациллы усиливают эпителиальный барьер с помощью различных механизмов, таких как индукция секреции муцина [206], улучшение функционирования плотных соединений [285, 319, 326], регуляция белков теплового шока [333, 364] и предотвращение апоптоза эпителиальных клеток [365].

   L. acidophilus АТСС 4356 оказывает противовоспалительный и анти-апоптозный эффект на эпителиальные клетки после непосредственного межклеточного контакта через активацию митогенактивирующейся протеинки-назы, предотвращение инактивации рецептора, отвечающего за эпидермаль-ный фактор роста [365]. L. rhamnosus GG оказывает специфический антиапоптозный эффект опосредующий подавления фактора некроза опухо-ли-а (TNF-а), стимулирующий активацию митогенактивирующейся протеин-киназы р38 [394]. Идентифицирован рецептор, служащий посредником проявления полезных эффектов у специфических штаммов лактобацилл. L. Acido-phillus NCFM вызывает экспрессию опиоидных и опиатных рецепторов в кишечных эпителиальных клетках, оказывая болеутоляющее действие в кишечнике наподобие морфина [277].

   Генетическая идентификация чистой культуры микроорганизмов

   Первичное изучение антагонизма проводили согласно следующей методике прямого антагонизма [14]. На дно чашки с плотной питательной ередой лактоагар (MRS) петлей в 2 мм наносили суточную культуру лактобацилл (концентрация 1x109 по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича) в виде прямой полосы в центре чашки. Для выявления антагонистической активности лактобацилл к определённым тестовым культурам, их подсевали в виде 18-часовой бульонной культуры. Для выращивания тестовых культур использовали оптимальные жидкие питательные среды. Посев тест-штаммов проводили петлей диаметром 1мм в направлении от зоны роста штамма лактобацилл, не касаясь её, и перпендикулярно ей.

   В качестве тестовых культур использованы следующие штаммы: Staphylococcus aureus 25923, Candida albicans 531, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtilis, Escherichia coli BVK 083. В качестве контроля использовался штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3 с известным спектром антагонистической активности. Учёт результатов проводили через 24-48 часов инкубирования при 37 С в термостате по величине зоны отсутствия роста тест-культуры. Контролем служил их параллельный посев на чашки с той же средой без испытуемой культуры. Степень антагонизма определяли по следующим критериям: 10 мм и менее — низкая, 10-20 мм — средняя, 21мм и более — высокая. Активность кислотообразования определяли титрометрическим методом (Лянная А. М., Гончарова Г. И., 1975). С этой целью суточные культуры лакто-бактерий центрифугировали и по оптическому стандарту мутности готовили 1 млрд взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия. По 1 мл такой взвеси вносили в пробирки с 9 мл жидкой лактосреды и культивировали при 37 С в аэробных условиях. Через 24-48-72 часа от начала культивирования вынимали по 2 пробирки, из которых отбирали по 5 мл культуральной жидкости и титровали её 0,1 Н NaOH. Количество щёлочи, пошедшей на титрование, соответствует количеству образуемой кислоты в 5 мл культуральной жидкости. Из полу 75 ченных значений вычисляли среднюю величину. Окончательный результат выражали в градусах Тернера: Т = А-К-20, где А — количество 0,1 Н щёлочи, пошедшее на титрование 5 мл исследуемой жидкости, К — поправка к титру, определяемая при титровании 0,1 Н раствора щёлочи 0,1 Н раствором янтарной кислоты, Т — величина, выражающая количество 0,1 Н щёлочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца. Определение лецитиназной активности Для выявления лецитиназной активности исследуемые культуры засевали на желточную среду. Через 18-24 часа инкубации при 37 С вокруг продуцирующих лецитиназу колоний наблюдали зоны опалесценции. Определение казеинолитической активности Продукцию казеиназы изучали экспресс-методом, предложенный Е. М. Горской соавт., модифицированной нами. На способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс диагностике дисбакте-риоза кишечника получен патент РФ на изобретение № 2235324 от 25 августа 2004 г [123]. Метод заключался в изучении казеинолитической активности суперна-танта фекалий. Для приготовления супернатанта фекалий необходимы 1-2 г фекалий и изотонический раствор хлорида натрия в соотношении 1:10. После 20 мин. отстаивания жидкость над осадком отсасывали и переносили в центрифужные пробирки, добавляя к пробе 1 каплю хлороформа, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин. и вносили в лунки с казеиновым агаром по 40 мкл. После 18-часовой инкубации в термостате зоны протеолиза проявляли добавлением 5% трихлоруксусной или соляной кислоты. Активность: низкая — диаметр зон до 10 мм, средняя — 11-15 мм, высокая — выше 16 мм. Определение уреазной активности Определение продукции микроорганизмами уреазы проводили, используя стандартный Urease Test Broth (ВВІ/, USA), который вносили по 150 мкл в лунки микропланшет для иммуноферментного анализа (ИФА). Затем в них добавляли по 50 мкл суточных микробных культур и инкубировали при 37 С в течение 18 часов. Реакцию считали положительной при изменении цвета среды с жёлтого на красный. Определение желатиназной активности Желатиназную активность исследуемых культур изучали ускоренным методом [70]. Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии желати-назы бактерий в питательной среде с желатином, фиксированном в виде тонкого слоя чёрной серебросодержащей эмульсии на полимерной фото- и киноплёнке, происходит гидролиз желатины. Это выражается в обесцвечивании плёнки и в появлении в среде чёрного осадка частиц серебра. Исследуемые культуры сеяли бляшками на соответствующие питательные среды культивирования, инкубировали сутки при 37 С. Затем в бактериальные бляшки с помощью стерильного пинцета вертикально помещали квадратики фотоплёнки, слегка погружая их в агар. Чашки инкубировали при 37 С в течение 24 часов. Положительной реакцией на желатиназу считали обесцвечивание квадратика плёнки и появление чёрных частиц серебра в среде вокруг кусочка пленки. Определение нуклеазной активности Дезоксирибонуклеазную и рибонуклеазную активности исследуемых культур определяли стандартными методами. Принцип основан на том, что бактериальные ДНК-азы и РНК-азы деполимеризуют соответственно ДНК и РНК. В результате при добавлении хлористоводородной кислоты (осадителя нуклеиновых кислот) агаровая среда, содержащая соответствующие нуклеиновые кислоты, становится непрозрачной, тогда как вокруг микробных бляшек, в случае продукции нуклеаз, образуются прозрачные зоны. Для определения ДНК-аз смешивали расплавленный и остуженный до 50 С 2% ПА и 1% ДНК-азный агар стандартный (Sigma) в соотношении 10:1, разливали в стерильную чашку Петри. Сразу же вносили 0,1 мл 10% раствора хлорида кальция, поскольку большинство нуклеаз являются метал-лозависимыми ферментами. После образования геля чашки подсушивали 30 мин. Исследуемые суточные агаровые культуры засевали бляшками по 20-25 культур на чашку. Посевы инкубировали при 37 С в течение 24-48 часов. Для проявления результатов опыта на поверхность среды наносили 5 мл 1 N хлористоводородной кислоты. Результаты регистрировали визуально в проходящем свете или на чёрном фоне. При положительной ДНК-азной активности микробной культуры вокруг соответствующей бляшки отмечали наличие зоны просветления радиусом 2 мм и более на мутном фоне среды. РНК-азную активность культур определяли аналогичным методом, но в качестве субстрата использовали 5% водный раствор дрожжевой РНК (Sigma).

   Морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов желудочно-кишечного тракта человека

   Супернатант суточной бульонной культуры лактобацилл получали центрифугированием при 7000 об/мин в течение 45 мин. Надосадочная жидкость, свободная от бактерий, представляла супернатант.

   Супернатант суточной бульонной культуры L. amylovorus БТ-24/88 и Lactobacillus acidophilus NK1 в разведении 1:7 в течении 24 часов культивировали совместно с тестовыми культурами микроорганизмов Staphylococcus aureus АТСС 25923, Bacillus subtilis АТСС 6633, Е. coli АТСС 25922, Shigella sonnei III № 1908, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Salmonella typhi-murium 5715, Candida albicans ATCC 885-653.

   Динамику роста и размножения микроорганизмов определяли измеряя оптическую плотность бульона при длине волны 540 нм на КФК-3. Биосовместимость исследуемых лактобацилл между собой и бифидо-бактериями определяли методом совместного культивирования на плотной питательной среде [36]. Суточную культуру исследуемого штамма, выращенную на жидкой питательной неселективной среде, наносили на поверхность плотной питательной неселективной среды в чашках Петри петлей диаметром 2-3 мм и оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капли. После этого, отступив 1-2 мм от края первого пятна, наносили каплю суточной тестовой культуры, выращенной на той же питательной среде. Растекаясь, вторая капля затекала на пятно исследуемой культуры, примерно на половину диаметра. В наложенной части культуры развивались при взаимном присутствии (совместное культивирование), конкурируя друг с другом. Свободные части пятен каждой культуры служили контролем жизнеспособности каждой из культур и всхожести бактерий на питательной среде. После подсыхания капли второй культуры чашки с посевами инкубировали крышкой вниз при температуре 37 С в термостате. Одновременно с основным опытом ставили контрольные опыты — наслаивали две капли исследуемого штамма и две капли тестовой культуры. Предварительный учёт результатов проводили через 18-20 часов инкубации, окончательный учёт результатов через 48 часов. Результат учитывали по наличию признаков подавления или даже зоны задержки роста чувствительной культуры.

   Для определения активности пробиотических штаммов лактобацлл в отношении вирусов проведена реакция нейтрализации в культуре клеток Нер-2 (Cincinnati), эпидермальной карциномы человека, с использованием штаммов полиовирусов Сэбина 1, 2 и 3 типов, полученных в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН. Культуры клеток Нер-2 рассеивали в культуральных пробирках и выращивали в термостате при 36 С. После микроскопирования отбирали пробирки с полностью сформировавшимся монослоем клеток. Готовили рабочее разведение вирусов полиомиелита 1, 2, 3 типов. Для этого в поддерживающей среде Игла MEM с 2% плодной сывороткой крупного рогатого скота разводили каждый тип вируса так, чтобы в рабочем разведении содержалось 100 доз вируса. В стерильные планшеты для титрования разливали суспензию лактобацилл, выращенную на жидкой среде MRS, и супернатант бульонной культуры по ОД мл для каждого типа вируса полиомиелита. Затем разливали вирус в рабочем разведении по ОД мл каждого типа. Смеси ставили в термостат при 36 С на 1 час, после контакта вносили по 0,2 мл в пробирки с культурой клеток с последующем выдерживанием в термостате при такой же температуре. Пробирки наблюдали на протяжении 5 суток. В течение этого времени оценивали качество монослоя клеток и регистрировали развитие цитопатического эффекта (ЦПЭ). Результаты реакции нейтрализации учитывали на основании подавления ЦПЭ вирусов полиомиелита. ЦПЭ считали положительным при разрушении монослоя не менее чем на 50%.

   Использованы 30 половозрелых белых лабораторных крыс самцов линии Вистар массой тела 180 г. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755). Все животные содержались при сходных условиях в отношении температуры, влажности и освещения, а также рациона питания (комбикорм ПК-120-1, Россия). На проведение экспериментов получено разрешение этического комитета ГБОУ ВПО Тверской ГМА Минздравсоцразвития РФ (протокол от 30.05.2011 г.).

   Перед проведением каждой из трёх серий экспериментов животные разделены на три группы: две экспериментальные (№ 1 и № 2) и одну контрольную группы по 10 крыс в каждой группе. Животным экспериментальной группы № 1 ежедневно в одно и то же время 3 раза в день per os в тече-ниє 7 дней вводили Salmonella typhimurium в количестве 2 мл 10 КОЕ/мл. Животным экспериментальной группы № 2 ежедневно в одно и то же время 3 раза в день per os в течение 2-х дней вводили Salmonella typhimurium в количестве 2 мл 10 КОЕ/мл, а затем с 3-го дня в течение 5 дней вводили через рот суспензию Lactobacillus plantarum по 1 мл 10 КОЕ/мл. Животным контрольной группы никаких препаратов не вводили, они находились на обычном рационе питания. Микробиологическое исследование фекалий белых крыс всех 3-х групп проводилось на вторые, пятые и седьмые сутки. Анализ состава и качества микрофлоры проводился стандартными бактериологическими методами. Крыс выводили из эксперимента на восьмые сутки передозировкой диэтилового эфира с соблюдением принципов эвтаназии.

   Забирали кусочки подвздошной кишки, печени, поджелудочной железы, надпочечника. Кусочки органов фиксировали в 10,0% растворе нейтрального забуференного формалина. После заливки в парафин готовили срезы толщиной 5-7 мк, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

   Данные экспериментов обрабатывались с помощью прикладной программы «Statistica» (Stat Soft Russia) и «Excel». Вычисляли средние значения, доверительный интервал среднего -95,000%, доверительный интервал среднего +95,000%, медиану, минимум, максимум, нижнюю квартиль, верхнюю квартиль, стандартное отклонение, стандартную ошибку, асимметрию, стандартную ошибку асимметрии, эксцесс, стандартную ошибку эксцесса [12, 15, 33]. Сравнение групп микроорганизмов проводилось методом параметрической статистики по критерию Шапиро-Уилка и непараметрическими методами с использованием дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса.

   Способность антагонистически активных штаммов лактобацилл формировать биоплёнки

   Для поиска генов, связанных с синтезом бактериоцинов, взяты лакто-бациллы, выделенные из полости рта и кишечника, проявляющие выраженную антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ (табл. 147).

   Все 3 проверенных штамма L. plantarum несли гены бактериоцинов plnEF. Для всех изученных в других лабораториях штаммов L. plantarum показано наличие этих генов, они являются консервативной частью локуса. По наличию других генов изученные штаммы 46к. и Юбзв. одинаковы и отличаются от штамма Збст. Штаммы L. plantarum по строению pin локуса предложено разделить на 7 групп [219]. По этой классификации штаммы 46к. и 106 зв. могут быть отнесены к 1-й или 3-й группе, штамм Збст. — к одной из минорных групп 2-й (4-й) или 5-й. У штамма 46 к., имевшего, высокую антагонистическую активность, и штамма 106 зв., имевшего слабую бактерицидную активность, выявлен один набор проверенных pin генов, ріп локус включает много генов и присутствует у всех изученных штаммов L. plantarum, как имеющих подобную активность, так и не имеющих её. В настоящее время трудно идентифицировать те гены и их мутантные варианты, присутствие которых обусловливает наличие антагонистической активности. Поскольку штаммы L. plantarum продуцируют различные бактериоцины, необходимые для их синтеза гены также могут быть различны. Нельзя исключить и наличия других локусов у L. pantarum, обусловливающих антагонистическую активность и отличных от pin.

   Все 6 проверенных штаммов L. rhamnosus, имеющих как выраженную антагонистическую активность, так и слабую, содержат гены пребактериоци-нов LGG_02380 и LGG_02400. Эти гены содержат и все 9 штаммов L. rhamnosus, чьи полностью секвенированные геномы представлены в Gen-Bank на сайте NCBI. Вероятно, генетические локусы, связанные с синтезом бактериоцинов, присуствуют у подавлющего большинства (может быть — у всех) штаммов L. rhamnosus, однако связь синтеза бактериоцинов с наличием определённого набора генов требует дальнейшего исследования.

   Все 6 проверенных штаммов L.fermentum не содержат ріп-генов L. pantarum и генов, обусловливающих синтез пребактериоцинов у L. rhamnosus. Исследованные гены, участвующие в синтезе бактериоцинов, являются видоспецифичными. «+/-» лактобациллы проявляют слабую антагонистическую активность Методом ПЦР проверено наличие 6 генов, синтезирующих предшественники бактериоцинов, у штаммов L.plantarum, L. rhamnosus, L. fermentum. Все проверенные 6 генов являются видоспецифичными. По наличию (отсутствию) проверенных генов 6 исследованных штаммов L. rhamnosus идентичны. Проверенные штаммы L. plantarum и L. rhamnosus подразделяются на две группы. Штаммы L. plantarum и L. rhamnosus, проявляющие выраженную и слабую антагонистическую активность, не различаются по наличию проверенных генов предшественников бактериоцинов.

   Антагонистическая активность лактобацилл изучалась на половозрелых белых лабораторных крысах самцах линии Вистар, руководствуясь приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. Проводили заражение 2-х экспериментальных групп белых крыс патогенным штаммом Salmonella ty-phimurium с последующим введением второй экспериментальной группе животных суспензии лактобацилл, Lactobacillus plantarum. Животным контрольной группы никаких препаратов не вводили, они находились на обычном рационе питания.

   Цитоархитектоника подвздошной кишки у крыс экспериментальной группы № 1 была сохранена и представлена слизистой, подслизистой, мышечной и серозной оболочками. В слизистой и подслизистой оболочках больных животных определялись отёк и выраженное полнокровие (рис. 127а). Кишечные ворсинки набухшие и увеличены в размерах (рис. 128а).

   Каждая ворсинка слизистой оболочки выстлана однослойным эпителием, который представлен тремя типами клеток: цилиндрическими, аргиро-фильными и бокаловидными. Цилиндрические клетки, называемые также всасывающими или каёмчатыми, составляли основную массу эпителиального пласта. Щёточная каёмка цилиндрических клеток, состоящая из плотно упакованных микроворсинок, была узкой. Число цилиндрических и аргирофиль-ных клеток (клетки Кульчицкого, энтероэндокринные клетки) в эпителиальном пласте ворсинок такое же (0,5% от общего числа клеток), как и в препаратах слизистой оболочки подвздошной кишки контрольной группы. В бокаловидных клетках ворсин и крипт происходят циклические изменения, связанные с накоплением и последующим выделением слизи. Она представляет собой щелочной секрет, содержащий значительное количество сульфа-тированных и несульфатированных гликозаминогликанов (ГАГ). После выделения слизи из клеток в них начинается новый цикл её образования. У животных экспериментальной группы № 1 отмечалось значительное увеличение числа бокаловидных клеток, они намного крупнее, чем у крыс контрольной группы (рис. 129а).

   В эпителиальном пласте имело место уменьшение числа межэпителиальных лимфоцитов. В собственном слое слизистой оболочки подвздошной кишки животных экспериментальной группы № 1, которая представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью, отмечались отёк, полнокровие, мелкие петехиальные кровоизлияния и выраженная преимущественно лим-фо-гистиоцитарная инфильтрация с наличием полинуклеарных лейкоцитов (нейтрофилов) и небольшого количества плазмоцитов.

   Отёк и воспалительная инфильтрация определялась также и в мышечной пластинке слизистой оболочки и в подслизистом слое. В мышечной оболочке подвздошной кишки выявлялись незначительный отёк и умеренное полнокровие. Серозная оболочка подвздошной кишки при сальмонеллезе ин-тактна.

   После курса перорального введения лактобацилл в подвздошной кишке животных экспериментальной группы № 2 отмечалось уменьшение отёка, полнокровия (см. рис. 1276) и выраженности воспалительная инфильтрации, ворсинки слизистой оболочки тонкие (рис. 1286), в составе воспалительного инфильтрата не определялись полиморфноядерные лейкоциты, число межэпителиальных лимфоцитов увеличивалось, щёточная каёмка цилиндрических клеток становилась шире, бокаловидные клетки небольших размеров, а число их уменьшалось и достигало контрольных значений (рис. 1296). Все это отражало особенности реактивных изменений подвздошной кишки в ответ на введение лактобацилл и коррелировало с данными, полученными другими исследователями [210, 339].

   Похожие диссертации на Симбиотические взаимоотношения лактобацилл и микроорганизмов желудочно-кишечного тракта

   Характеристика внутриутробного инфицирования новорожденных микроорганизмами урогенитального тракта женщинЛаврова, Дарья Борисовна

   АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ НОВОГО НИТРОФУРАНОВОГО СОЕДИНЕНИЯ К-(5-НИТРОФУРФУРИЛИДЕН)-5-НИТРОФУРАН-2-(Н-АЦЕТИЛ) КАРБОКСАМИРАЗОНА (ПАП-49) В ОТНОШЕНИИ САПТОТРОФНЫХ И УСЛОВНО ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТерехов, Владимир Иванович