Введение к работе
Актуальность проблемы. Отмечающийся в настоящее время
неуклонный рост числа заболеваний, связанных с нарушением биологического равновесия между макроорганизмом и его микробной флорой, а также успешное применение препаратов пробиотического действия при их лечении, вызывает необходимость значительного увеличения выпуска последних (Григорьев, Яковенко, 1997; Бондаренко и др., 1998; Смирнов, Сорокулова, 1999). Повышение эффективности производства пробиотиков связано с совершенствованием способов их получения и контроля. Массовый выпуск и широкая номенклатура препаратов для бактериотерапии предполагает оптимизацию методических подходов при их контроле. Представляется рациональным комплексное решение данной задачи, которое включает унификацию методик контроля, разработку экономичных и эффективных питательных сред и ограничение их номенклатуры, исключение или ограничение применения патогенных и условно-патогенных тест-штаммов, разработку экспрессных способов контроля на основе современных методов биоиндикации. Исследования, связанные с оптимизацией контроля пробиотиков должны способствовать его адаптации к условиям массового производства препаратов, снижению- трудоемкости, продолжительности и материальных затрат на его проведение, и, следовательно, повышению эффективности.
Цель настоящего исследования - совершенствование методов контроля специфической активности препаратов пробиотического действия. Основные задачи исследования:
Разработать унифицированный комплекс питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата для контроля специфической активности пробиотиков.
Провести сравнительное изучение изо-, гомо- и гетероантагонистической активности производственных штаммов Escherichia coli М-17, Lactobacillus spp. с использованием теста отсроченного антагонизма на плотных питательных средах.
Разработать способы контроля антагонистической активности препаратов пробиотического действия без использования патогенных и условно-патогенных тест-штаммов.
Оценить возможность применения реакции ингибирования микробиолюминесценции для контроля антагонистической активности пробиотиков.
Научная новизна. Показана возможность использования питательной основы, включающей молочную сыворотку и дрожжевой аутолизат, в качестве универсальной при конструировании питательн .г^зфеддд^^дідщедрсшанш]
БИБЛИОТЕКА ]
ОЭ ТОТ/ »i*J ~|
производственных штаммов Bifidobacterium bifidum 1, . coli М-17,
Lactobacillus spp. Экспериментально обосновано применение сывороточно-дрожжевых сред для проведения и унификации контроля специфической активности пробиотиков. Проведено комплексное изучение изо-, гомо- и гетероантагонистических свойств производственных штаммов на основе использования теста отсроченного антагонизма с применением различных плотных питательных сред. Установлено, что определение антагонистической активности пробиотиков, предусматривающее оценку изо- и/или гомоантагонизма, способствует увеличению информативности теста отсроченного антагонизма и позволяет ограничить применение патогенных и условно-патогенных тест-культур. Впервые предложено использовать реакцию угнетения микробиолюминесценции для экспресс-оценки антагонистической активности пробиотиков. Определены особенности и условия проведения микробиотестирования для различных препаратов, а также его преимущества в сравнении со способом отсроченного антагонизма.
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований разработан производственный способ получения сывороточно-дрожжевой питательной основы, которая использована при создании унифицированного комплекса жидких, полужидких и плотных питательных сред, обладающих биологическими параметрами, необходимыми для контроля специфической активности пробиотиков. Предложена схема использования сывороточно-дрожжевых сред при контроле препаратов с учетом специфики определяемых параметров и культуральных свойств бактерий производственных штаммов. В рамках расширения сферы применения регламентированных питательных сред предложено использовать среду МРС для контроля ацилакта. Разработан способ контроля пробиотиков с использованием непатогенных культур в тесте отсроченного антагонизма на плотной питательной среде. Определена специфика проведения теста и количественные параметры оценки для каждого препарата и производственного штамма (Патент РФ №2177152). Предложен оригинальный экспресс-способ определения антагонистической активности препаратов для бактериотерапии на основе реакции угнетения биолюминесценции тест-штамма Е. coli lum+ С-50. Определены методические приемы проведения и количественные критерии оценки результатов теста (Патент РФ №2187801). Результаты исследований использованы при разработке нормативно-технической документации: Фармакопейная статья предприятия «Лактобактерин порошок», Регламент производства «Лактобактерин порошок», Изменение к Фармакопейной статье предприятия «Лактобактерин сухой», Изменение к Фармакопейной статье предприятия «Бифидумбактерин сухой». Подготовлены и утверждены
Фармакопейная статья предприятия 42-0028220301 «Колибактерин сухой» и Фармакопейная статья предприятия 42-0028220201 «Бификол сухой». Основные положения, выносимые на защиту:
Унифицированный комплекс питательных сред на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата целесообразно применять для проведения контроля специфической активности пробиотиков.
Использование способа определения антагонистических свойств пробиотиков, включающего оценку изо- и гомоантагонистической активности, позволяет ограничить применение патогенных и условно-патогенных тест-культур при их контроле.
Для экспрессного определения антагонистической активности пробиотических препаратов целесообразно использование реакции ингибирования микробиолюминесценции.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Уфа, 2000; XIV Коми республиканской Молодежной научной конференции, Сыктывкар, 2000; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», посвященной 105-летию Пермского НПО «Биомед», Пермь, 2003. Диссертация апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед».
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Полученные результаты исследований защищены двумя Патентами РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 292 литературных источника, из них 172 отечественных и 120 зарубежных авторов, приложения.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории пробиотиков в соответствии с планом НИР филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер государственной регистрации темы 01.200.1.08828).
Похожие диссертации на Совершенствование методов контроля специфической активности пробиотиков
