Введение к работе
ДКИЭДЕ9Р.ПиЯЕ8Й1да« Интерес к микробным препаратам имеет длительную исторяв, но в последние годы он значительно усилился в связи с тем, что широкая химизация сельского хозяйства приводит к загрязнению химическими веществами окружающей среды, пищевых продуктов растениеводства и животноводства.
Использование антибиотиков л качестве кормовых добавок для стимуляции роста и лекарств для лечения и профилактики болезней вызывает нарушение нормальной микрофлоры человека и животных, нарастание числа штаммов-возбудителей заболеваний, характеризующихся полирезистентностью к действий антибиотиков.
Микробные препараты, изготовляемые на основе молочнокислих бактерий и других симбионтов желудочно-кишечного тракта, в отличие от химйогерапевгических средств способствуют нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта и не вызывают вредных юбочных явлений. Они жгут использоваться в качестве биологических консервантов при заготовке сочных кормов.пере-работке плодов и овощей, в составе кормовых добавок и лечебно-профилактических препаратов для молодняка сельскохозяйственных животных и птиц.
Для биологического консервирования растительных кормов рекомендуются в основном моно- и смешанные культуры молочнокислых бактерий. При этом одни и те же препараты зачастую используются для консервирования как легко-,, так и грудноси-лосушшхся растений. Силосование грубых кормов в последнем случае возможно лишь после предварительной обработки, а также в смеси с легкосилосующимися растениями или с различными добавками: зерноотходами, мукой, мелассой, сывороткой и т.д.
Институтом микробиологии и вирусологии ЇЇАН Республики
Казахстан предложена новая технология заготовки силоса с
использованием трех видов сухих бактериальных заквасок,специ
ализированных для определенного вида растительного сырья
(Соколов,' 1965, 1970; Шэмис, 1970; Березина, 1976; Базанова и
др.,1977; Баяхуноз, Попянко, 1970; Березина, Саубекова,1983).
Препарат АМС готовится на основе а мило ли ти чес ко го молочно
кислого стрептококка Streptococcus lactis diastaticus И
используется для силосования трудносилосующихся растений;
препарат ШБ, созданный на основе пентозо сбраживающих молоч-
нокислых бактерий Lactobacillus pentoaceticum , рекомендовал-для силосования соломы; препарат ПКБ, содержащий пропионово-
КйСЛые баКТерИИ Propionxbacterium shermanii , СЛУЖИТ ДЛЯ
силосования кукурузы и других высокосэхэрпсгьас растений.
Эффективность препаратов была доказана при консервировании растительного сырья в колхозах и совхозах Казахстана, России, Украины, Кыргызстана (Нугматканов и др.,190»Ахмедиев, Балагутина, 1991; ГДихяева, 1988). В связи с необходимостью расширения производства и применения биоконсервангов встал вопрос о разработке технологии их промышленного производства.
Микробяотаки по характеру воздействия ка животный организм можно условно разделить на лечебно-профилактические и физиологические. Препараты физиологического действия готовят на основе Целого ряда микроорганизмов: молочнокислых, пропионовокис-лых я целлщозолити чесних бактерий, дроажей и др. Они оказывают положительное воздействие на продуктивность животных путем синтеза витаминов, незаменимых аминокислот, органических иг слог, гидролитических ферментов, повышающих усвоение корма." Наиболее изучены микробиотики лечебно-профилактического действия. Однако большинство из них лишь усиливает действие антибиотиков, а не заменяет их или используется после антибиотико-герапии для восстановления нормальной микрофлоры кишечника. Часты случаи, когда применение рекомендованных препаратов не эффективно, так как не учитывается характер инфеквди.домини-рущей в хозяйствах. В рядя исследований, особенно на птицах, при использовании микробиотикоз получены противоречивые результаты, что свидетельствует о недостаточной изученности пробяотическнх препаратов. Не всегда определена способность входящих в препараг микроорганизмов прикрепляться к слизистой кишечника и предупреждать ого колонизацию патогенными микроорганизмами.
Анализ и обобщение теоретических и прикладных исследований показал актуальность разработки повій микробных препаратов, предназначенных в качестве микробиотиков физиологического и лечебно-профилактического действия, для консервирования растительного сырья.
Цйіі^ зала ч#,ИСл еда бзвия. Целъо .настоящей работы было создание на основе молочнокислых, пропионо во кислых и целлшю-
эолитических бактерий-новых лечебно-профилактических препаратов и кормовых добавок для сельскохозяйственных животных и домашних птиц,"микробиологических консервантов для широкого набора растительного сырья и разработка технологии их промышленного производства.
Исходя из поставленной цели> определены следувщие задачи:
изолировать из желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и домашнах птиц высокоактивные штаммы микроорганизмов с заданными свойствами: антагонистическая активность к патогенным разновидностям колибактеряй, сальмонелл, иигелл; устойчивость к лекарственным препаратам; способность к адгезии, а также к синтезу витаминов группы В, незаменимых аминокислот, гидролитических ферментов;
создать на основе отобранных штаммов лечебно-профилактические препараты, эффективные против колябактериозов и смешанных кишечных инфекций;,
составить кормовую добавку, гюзволявдус повысить переваримость, клетчатки, нормализовать белковый обмен и повысить продуктивность животных;
повысить у исходных штаммов молочнокислых и прошоново- . кислых бактерий, рекомендованных для консервирования растительных кормов, способность к накоплению биомассы, кисяогооб-раэование при сбраживании углеводов растений; ангагонисгичес-кую активность до отношению к гнилостной микрофлоре и микроскопическим грибам, устойчивость к кормовым антибиогикам.геп-ловому воздействию;
определить условия культивирования микроорганизмов, обеспечивавшие максимальное накопление биомассы, высокую оио-хим0ческую/ангагонис.тическую активность;
изучить ксеро- и термочувсгвигельросгь микроорганизмов и разработать мзтод их обезвоживания;
выявить оптимальные условия хранения и реактивации высушенных препаратов;
проверить эффективность разработанных микробиогиков на 'сельскохозяйственных животных и домашних птицах;
организовать промышленное производство бактериальных препаратов для консервирования растений.
В данной работе приведены результаты исследовани2,выполнен-ные под руководством и при личном участии автора в 1969-1992 гг.,
опубликованные в научно-технической литературе и внедренные в микробиологическую промышленность.
- йМЩЕЭ&.ЯЗДЯИЗл При исследовании микрофлоры желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных г.пбогных и птиц выделены микроорганизмы-антагонисты к различны:.: возбудителям кишечных заболеваний, продуценти витаминов С, группы В, незаменимых ампнокислот, гидролитических ферментов, с повышенной способностью к адгезии, которые, могут Сыть использованы гри создании новых микробиогиков направленного действия.
Отобрана КУЛЬГУРа Lactobacillus casei 173а С ЕИрОКЯМ
спектром антимикробной активности, обусловленной антибиотиком пептидной природы с Уф-спек трои 300 км, о тли чз едете я от ранее известных.
ДЛЯ КУЛЬТУР S.lactis diastaticus, P. shcrnanii, L. pen-
toaceticum , ранее предложенных для использования в кормо-
производстве, впервые установлены границы чувствительное ти к температурному фактору, обезвоживанию, выявлены стимуляторы их размножения и метаболизма (экстракты некоторых растении,змиш-кислогы, отходы производства антибиотика розеофунгика).
Установлена высокая метаболическая активность бактерий Lac
tobacillus brevis Б-3 ,Lactobacillus casei 139, Lactobacillus
casei - I73a, P. shermanii-15
г.ри совместном культивировании, обусловливающая широкий спелгр их антимикробной активности.
Разработаны научкиз .основы создания мпкробпотиков 'из молочнокислых, пропнонОЕОкпслых и делдюлозолигичеекпх бактерий.
Йэ^дагаска^ззэ^^здгь.В результате теплового воздействия
НЗ ЧОЛОЧКОКИСЛае бактерии S.lactis diar.taticu.s И L. pentos-
ceticuti подучены варианты, на основе которых созданы сухие биопрепараты для консервирования растений с повышенным сроком годности. Разработана технология их промилле иного получения и организовано серийное производство на заводах микробиологической прсмыаленкосгп.
Разработай способ приготовления лигагальной среды из фуга тоб бактерий, позеолящпй организовать процесс производства сухих бактериальных концентратов трех видов по замкнутому Циклу (Д.с.'й 1423586; А.с. І3297І7; рзд. предлоге ние,удоеговорение, й 13).
Выявлены стимуляторы роста.шлочнокислых и пропионовокис-
лнх"оакгерий:.. экстракты- верблюжьей колючки'И полыни-метель чз'-\" той,-"отходы"производства '.2нтибиагяка.розеофунгина;('гА^с;.,й, ." 1762В37^"А.с. .№..I7H7ffi5,:6;2fOKaccsEaeilius;subtilis:BKnHrC'A.c. - .,,
j* 1677071)::^.
Установлено,-что-для. достяяения'необходидокгсоогношэшяг.:.. Ky3IETJpS'n.actis-. diastaticus И. P. shermanii.'-м (1:1); ІПреДУ-~ ~-смотреиного -гехшческвкя уело виями:для/.коне.чного .'продукта, СОВ- - -мес гное "их вирапгявэние" -"следует гфОБОдигь'при::гешерагуре.31-32С:г\' / А.сі .№.1676573173 і.
Предложвнгсдаетгі:осаяденая'биомассн"бакї9рий:о:поігощьв:реаг -.л -генгов:(А.с..й.І09І549).:';„
Создана кормовая'добавка: на основе^цедавяозодитяяэскигуи-' " пропгонавокислаг. бактерий, ;.адсорбированвн:"на бенгошгте;Препараг: -: спосоЗствуектзавншешпг.ра-сдевления. клегчагки :кориа; '-увеличенив:...-. сингеза-:.ввгамята:-.В^2? ГОЕШениптрезервной'щёлочносги'.тфовй,"!"-;, нopшлйзaдаяI'йеткoшто:ofe!eнз,:шEШЯeEяn^-xфoд7Ttt]пзгocfГиrzзJвoг--:,: -ных" (A.6:.S-I684372).:::),
На ocH0Be"I>actobaciXlu*lhrevrsB«3""l!'Proi>tonibact«riumivi~ shermsnii:.:-.15 создан:ношй;"Л9чдбно-про(|шгактачесотй-"прехора-т: -,: лактовит-К,-ізффєйгивннй лртглро^лзкгпке:-'И'-леЧ5Шг.яалибахтг-'~~ -риозов."донашвйг:.птис:я-ггяят;.(ІІолйаїг;рвшетпїе"іга заявке'й" 4712492/15 ^приоритет от 29.06.89.)» ).
Разработав:новый-лйЧййно-профялакгпческаа.преяарат^олплгк- > го вит-'.на основе.молочнокяслыхОактергйь.ЪгвуДЕ' ' Б-3,:- , L. :..,. casein 139^-cssei ;І73а"и. прошгоновокисляг бактерий: :.р. ;-shernsnii-- 15 прогав;'см8!лэвной "Ешпечной'инбдкши;--- -.
Отработана .технология -получения микрабйогиков. .:;.
Необходишоть:исследований:імкроорганязшв-сшбаонтов же-." -удочно-кишчного: тракта для:создания,шкробі!отиіюв:'направлен-!- -ого-дейсгвяя;-; новыйлечебно-профилактяческя8':препзраг"лакго-:" ит-К,- созданный:ъ*а основе ь.ьтє-vxb-.В-З'.ш': p. shermanii -I5,-:r. зедназначенный;для-лечения колибакгеряозов"сельскохозяйствен- .-инпвотньк: и пгици. ловшения реэпстентгоспг.кдругямгзаболе-" .-шпя:л; -.
- яовыЯ:леЧйбно-профяла'кгическйй:препараг:полЕлакговиг^".:-", зяанный' на основе' шлочнокяшшх.:бакгерий ir.brevis-.-..B-3^ ь. '-. isei-I73a',"L;.casei- І39!и'пропионовоки слых: бактерий: :: P.sher-:—-па.и.. - 15 - антагонистов против смешанной"кшечной'ин-"";-
фекции (в том числе сальмонеллеза) и продуцентов витаминов С, группы В, незаменимых аминокислот, протеолитических ферментов;
- новая кормовая добавка бенгобак, составленная из целлю-
лозолигических бактерий Cellulomonas flavigena - 22 И
пропионовокислых бакїерий P.shermanii- 15, адсорбированных на бентоните, и предназначенная для нормализации белкового обмена и повышения продуктивности животных*
- ШТаММЫ МОЛОЧНОКИСЛЫХ бактерий S.lactis diastaticus АМС
БН-23 и ь. $entoaceticumi3MB-lO, характеризующиеся повышенной активностью накопления биомассы и высокой кислотообразующей способности при сбраживании углеводов растительного сырья;
- технология производства бактериальных препаратов для сило
сования растительного сырья.
' Д$9&ШЫ&0ВД$«. Материалы диссертации доложены и обсуждены на П и УП съездах ЙЮ (Рига, ',IS3U; Алма-Ата, 1985); 9-ом международнйм симпозиуме по'.'непрерывному культивированию (Чвхо&швакия, '1337);'дя/? .'межведомственных совещаниях по проблема": 'Разработка и организация 'производства бакпрепарагов на основе молочнокисл^'бактерий (Вильнюс, 1983; Вышний Волочек, 1937); координационном совете по ветеринарии МСХ РК (Алма-Ата, 1985); 9-ти всесоюзных конференциях (Москва, 1973; Фрунзе, 1976; Пущине, 1978; Душанбе, І98І; Киев, 1981; Алма-Ата, 1934; Ташкент, 1939; Алма-Ата, I99Q; Степногорск, 1991).
ШЙададц^ Основные материалы диссертации опубликованы в 47 печатных работах.
СИдатШЫиЗбьем^ра&цгы. Диссертация состоят из введения, обзора литературы, раздела, включающего описание объектов исследований и методики работы, 4 разделов, содержащих результаты экспериментальных работ автора, заключения, выводов, списка цитированной литературы, содержащего ззэ источников. Диссертация, изложена на 264 страницах машинописного текста, содержит 103 таблиц и із рисунков.
Объекты и методы исследования
В работе использовали культуры амилолитического молочнокислого СГреПГОКОККа Streptococcus lactis diastaticus (АМС), ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ бактерий Propionibacterium shermanii (ПКБ) , ПеНГОЗОСбраЖИВаюЩИХ. МОЛОЧНОКИСЛЫХ бактерии Lactobacillus
pentosceticum(DI>lB), ЦЄЛЛШОЗОЛЙГИЧєСКИХ баКГдриЯ Cellulomonas
fisvigens (ЦЛБ), полученные из коллекции Института
микробиологии и вирусологии НАН РК, и 185 нейдзнгифяцированных штаммов бактерий, выделенных нами из желудочно-кишечного тракта жвачных животных и птиц.
Молочнокислые бактерии выращивали на сусле, средв МРС,а также сахаро-щнеральных средах с кукурузным экстрактом.Дро-пионовокислые бактерия культивировали на кукуруз но-глюкоз ной среде с сернокислым амшшем и кобальтом хлористым, целлолозо-литические бактерии - на среде Гетчинсона, соломенном отваре, а также на кукурузно-сахэрной среде с добавками различных источников углерода и аэота.
Оптимизацию состава питательной среды осуществляли с помощью метода математического планирования'эксперимента (Бирюков, 1975).
Морфологию клеток бактерий изучали на световом микроскопе Poiyvar; электронных микроскопах U-I00 В ( Япония), 3M-I25 (СССР).
Для определения ультраструктури клеток сухие препараты растворяли в воде в соотношении 1:1000, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Осадок фиксировали 2,5Й-ным раствором глсгарового альдегида' в ацетатном буфере в течение і,5 ч с последующим фиксирование!-! в I^-ном растворе четырех-жиси осмия.ттриготовленного на том же буфере. Дегидратаций ібьекгов проводили по общепринятой схеме; зали вали в смесь поксидных смол. Ультратонкие срезы готовили на ультра томе В-4. Препарат просматривали на электронном микроскопе СМ-7А ри ускоряющем напряжении 60 кв.
Инденгификацяю микроорганизмов до вида проводили по опре-елигелю Берге ( Berge,I974; Берге, 1930).
Титр бактерий определяли путем ряда последовательных раз-здений в стерильной водопроводной воде и высева их в агари-званную питательную среду с последувдим подсчетом выросших )лоний.
Наличие про геолиги ческой и амилолиги ческой активности .танавливали по зонам гидролиза казеина и крахмала на твердых -тагзльных средах, целлмозолиги ческой активности - по стени разложения целлатозы в среде Гетчинсона и чашечным мего-м по зонам гидролиза Na -КМЦ. Амилолитическую активность
определяли также йодометрпческям методом (Рухлядева,І98І).
Содержание сахара устанавливали методом Бертрана, органических кислот - по ВигнерУ- и с помощью газояядкостной хроматографии, кислотность - титрованием 0,1 N HsOH и выражали в градусах Тернера.
Концентрации витаминов группы В определяли методом диффузии в агар с использованием в качестве гесг-кульгур следующих
МИКроаргаНИЗКОВ: ДЛЯ Определения ВИТаїЛЦна В - Escherichia
coli ПЗ-3; Bj -Endomycos nognusii Ludvig ЖІЇ-Ш9; B2 - Ostt,
rayces japonicus Kudr.ncw ВШУ- 655 і Bg - Zygofa'b. spor.a r.ar-
xiane Hansen ЕКЇГ-832; Bg - Deharionyces dispcrus
BKviy-1034; Br, - Zygosaccharoayces Eailii Ш'У-853; Зр, -Saccharcnyces carls^ergensis (Hansen) Dekker BKiIF-1171;
B9-II "Hhodotorula sp. 45 (Одинцова, 1959), а также фотометрическим методом на спектрофотометре спекорд " UWIS " (ГДР).
Определение витамина С проводили пирометрическим методом (Ильченко, 1974).
Качественный и количественный состав аминокислот исследовала на вмдноки ело гном анализаторе марки ААА-339 ЧССР после соответствующей подготовки пробы. Подсчет количества аминокислот проводили по площадя пиков на автоматическом интеграторе марки 26-С.
Ксеро- а гермограымы бактерий составляли да методу M.S. Бекер (1967).
Для изучений антибиотической резистентности использовали общепринятую методику дисков, пропитанных растворами антибиотиков в следующих концентрациях: стрептомицин, хлортетра-цлклип, окевтвтрациклйн, эритромицин, хчорамфвнакол-50 мкг/мл; неошцин, падим'иксин, капамнцын - 30 мкг/мл; одеандо-мавдш-15 мкг/ыл; антибиотики нитрофуранового ряда - 50 іясгЛіл (фуразолидон - 15 мкг/мл).
"АдгезиЕНУв активность бактерий изучали по методу разработанному С.С.Гизатулиной с соавторами (1289), на эритроцитах морской сванки и петуха. Реакцию оценивали в степенях: I степень - отрицательная реакция, 2 - отсутствие адгезии, 3 -средняя адгезия, 4 - высокая адгезия» Для получения данных по антиинтерфероновой активгости использовали препарат человеческого лейкоцитарного интерферона в концентрации 1/40 и 1/60. В качества индикатора наличия или отсутствия интерферона применяли культуру Corynebacteriua xerosis.
Ангибиотические -вещества, образуемые малочнокяслыми бактериями, экстрагировали из фильтрата куль тура ль вой жидкости бутанолом, из биомассы - ацетоном. Для первичной их идентификации использовали следующие методы: определение антимикробного спектра, тонкослойную хроматографию (ТСХ)'и спектрофотометри».
Антибиотическую активность устанавливали методом диффузии в агар (Егоров, 1986) в отношении 27-ТЕСТ-микроорганизмов,
В ТОМ ЧИСЛЭ граЮТриЦаГеЛЪНЫХ 6aKTePHM:Escherichia coli 79/1,
E.coli 0/78,E.coli 76/1,Б. coli47,Salmonella typhimurium, S.
dublin.Proteus mirabilis, Gersinia enterocolitica,Enterobacter
agglomerance.Pseudoraooas aeruginosa,Hafnia sp.,Citrobacter sp.,
Serratia marcesSenee .Klebsiella pneumoniae 444, Vibrio chole-
rea ; грамПОЛОНИТеЛЬНЫХ баКГеРИЙ: Staphylococcus aureus.
Bacillus subtilisATCC 6633, Bacillus nycoides R- 537, Micrococ
cus luteus ATCC 934I,Micrococcus sp; кислотоустойчивых
6aKrep0K:Kycobacterium rubrum ; дрояжеподобных грибов: Canaida utilis,Candida albicans, Aspergillus niger.
Антибиотики хроматографироваля на пластинах " siiufoi " марок н и uv 25* ( Avaiier ,ЧССТ) в системе растворителей хлороформ-метанол (10:1), обнаруживали их на хроматограммах визуально, биоавтографически и да свечению в-УФ-свеге. Отдельные компоненты антибиотических веществ накапливали препаративной, хроматографией. После разделения препарата на ся-луфоле активные зоны с пластинок снимали' вместе с основой , элюировэли этанолом (96). фильтровали. УФ-спектры препаратов в этаноле измеряли на слектройотомегре спекорд "uwis " (ГДР).