Введение к работе
Актуальность проблемы.
Разработка холерных вакцин, вызывающих образование у
человека напряженного иммунитета, до сих пор является одним из
важнейших направлений в исследованиях по проблеме «Холера». В
отличие от клинически выраженной холеры, которая, видимо,
обеспечивает защиту от повторного заражения возбудителем холеры на
несколько лет, убитые холерные вакцины вызывают лишь частичную
защиту (Finkelstein R. А., 1992). Такая относительно низкая эффективность
холерных вакцин может быть обусловлена недостаточным содержанием
протективных антигенов, среди которых основными являются 01-
антиген сероваров Инаба и Огава, адгезины, В-субъединица холерного
токсина I (токсин Vibrio cholerae классического биовара) и II
(токсин V.cholerae биовара эльтор) типов, обеспечивающих,
соответственно, формирование антибактериального,
антиколонизируюшего и антитоксического иммунитета.
К настоящему времени созданы различные типы холерных вакцин:живые; убитые целыюклеточные (корпускулярные); химические; ферментные; пскусственноклеточпые. Однако лишь некоторые из них получили практическое применение. Одной из таких вакцин является химическая вакцина холероген-анатокснн, содержащая 01-антиген сероваров Инаба и Огава и анатоксин, формирующая образование антибактериального и антитоксического иммунитета при холере.
Для приготовления указанной вакцины используют высокотоксигенный штамм V.cholerae 569В серовара Инаба, а также производный этого штамма V.cholerae КМ76 серовара Инаба, являющігйся пшерпродуцентом холерного токсина (Джапаридзе М.Н. с соавт.,1991; Наумов А.В. с соавт., 1992). Для внесения в вакцину 01 -антигена серовара Огава дополнительно выращивают нетоксигенный штамм V.cholerae 41 Огава. Выбор штаммов 569В Инаба и КМ76 Инаба был обусловлен их уникальным свойством продуцировать и секретировать в культуральную среду значительное
количество холерного токсина, а также ряд других протективных антигенов. Однако клетки названных штаммов синтезирую! незначительное количество адгезинов (Jonson G. et al.,1989;KetleyJ.M. et al., 1990; Levine M.M. et al. 1988),которые в настоящее время считаются одними из основных протективных антиленов, обеспечивающих формирование секреторных антител, препятствующих бактериально!" колонизации тонкого кишечника. Поэтому, одним из приоритетных направлений в повышении защитных свойств холерных вакцин являете» создание производственных штаммов холерного вибриона, продуцирующих повышенное количество адгезинов. Кроме того, штаммы С ПОВЬІШЄННОі" продукцией адгезинов должны также синтезировать значительное количестве В-субъедшшцы холерного токсина I и II типов, обеспечивающих формирование антитоксического иммунитета при холере. Получение таких штаммов откроет новые возможности для усовершенствования холерных вакцин.
Один из возможных путей конструирования штаммов с повышенной продукцией адгезинов состоит во введении в клеткг холерного вибриона чужеродных генов адгезнна CFA1, обнаруженногс у энтеротоксигенных штаммов кишечной палочки, выделенных от человека. Этот адгезии участвует в колонизации тонкого кишечникг человека, непосредственно взаимодействуя с микроворсинками или гликокаликсом эпителиальных клеток.
Клонирование к настоящему времени структурных генов холерногс токсина I и II типов и его В-субъединицы позволяет создавать штаммы с повышенной продукцией этих белков. Однако накопленная информация по этому вопросу является недостаточной. До сих пор нет сведений с возможности стабильного наследования в клетках холерного вибрионг двух или более рекомбинантных плазмид, контролирующие биосинтез необходимых протективных антигенов. Отсутствует также информация об особенностях экспрессии хромосомных I: плазмидных генов в таких штаммах. Вместе с тем, получение и аналиг штаммов холерного вибриона с заданным набором протективных антигенов за счет введения в клетки этого возбудителя различных рекомбинантных плазмид может внести существенный вклад е изучение плазмидно-хромосомных взаимоотношений и способствовать
решению такой практической задачи как разработка более эффективных вакщш.
Цель работы- создание и изучение свойств изогенных штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией адгезинов и В-субъединицы холерного токсина.
Задачи исследования:
-
Ввести путем конъюгации плазмиду pCFAl энтеротоксигенной кишечной палочки в клетки изогенных штаммов V.cholerae 569В Инаба и КМ1801 Огава (классического биовара).
-
Изучить особенности наследования и экспрессии генов cfal, контролирующих биосинтез адгезина CFA1, в клетках холерного вибриона.
3. Определить оптимальные условия культивирования для
биосинтеза клетками холерного вибриона чужеродного адгезина CFA1
-
Получить штаммы с дополнительной продукцией В-субъединицы холерного токсина эльтор путем введения в созданные изогенные штаммы V.cholerae 569B(pCFAl) и KM1801(pCFAl) рекомбинантных нлазмид с клонированными генами ctxAB-эльтор и ctxB-эльтор.
-
Получить очищенный адгезии CFA1 и антитела к нему для выявления продукции адгезина CFA1 созданными штаммами холерного вибриона.
Научная новизна работы.
Впервые получены изогенные штаммы холерного вибриона классического биовара сероваров Инаба и Огава с дополнительной продукцией таких протективных антигенов, как адгезии CFA1 и В-субъедшшца холерного токсина эльтор.
Ъ'становлено, что оптимальными условиями для экспрессии чужеродного адгезина CFA1 в клетках холерного вибриона являются культивирование па CFA-arape в течение 24 час при 37 С и последующее выращивание в течении 18 час при 37 С в триптиказосоевом бульоне. В этих условиях адгезивная активность холерных вибрионов с плазмидой pCFAl повышается в 8-30 раз по сравнению с исходными штаммами.
Впервые показано, что в клетках холерного вибриона классического
биовара могут стабильно наследоваться и эффективно экспрессироваться две рекомбинаатные плазмиды, контролирующие биосинтез адгезина CFA1 и В-субъединицы холерного токсина эльтор.
Впервые установлено, что присутствие в клетках холерного вибриона чужеродных клонированных генов адгезивности и В-субъединицы холерного токсина эльтор, находящихся в составе плазмид, не влияет на экспрессию." хромосомных генов, контролирующих продукцию собственных протективных антигенов.
Получен очищенный адгезии CFA1 и полнклональные антитела к нему, что позволяет определять продукцию адгезина CFA1 у холерных вибрионов в дот-иммуноанализе и реакции преципитации.
Практическая значимость.
Депонированы в Российской коллекции патогенных бактерий «Микроб» один моноплазмидный и три днплазмидных изогенных штамма V.cholerae классического биовара сероваров Инаба и Огава, несущих рекомбинантные плазмиды, кодирующие биосинтез адгезина CFA1, холерного токсина эльтор и В-субъединицы холерного токсина эльтор. Данные изогенные штаммы с повышенной продукцией протективных антигенов могут быть использованы для получения холерной химической вакцины холероген-анатоксин.
По результатам работы составлены «Методические рекомендации по определению адгезина CFA1 у рекомбинантных штаммов холерного вибриона в дот-иммуноанализе», которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧП «Микроб» (протокол N7 от 12.03.1997г.) и утверждены директором РосНИПЧП «Микроб» по учрежденческому уровню внедрения.
Выделен очищенный препарат адгезина CFA1 и получены полнклональные антитела к нему, позволяющие определять продукцию адгезина CFA1 у холерных вибрионов в иммунологических реакциях. Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговой апрельской научной конференции института «Микроб» 1994 г., на I съезде Вавіїловского общества генетиков и селекционеров 1994 г. и на межлабораторных научных конференциях института «Микроб».
II у б л и К а ц П и. По теме диссертации опубликовано 5 научных статей.
Объем и структура диссертации.