Введение к работе
Актуальность темы.
В последние десятилетия в клинической практике наблюдается снижение эффективности традиционной терапии ряда заболеваний, обусловленное ростом числа антибиотикоустойчивых штаммов (Hooper et al, 2015; Karam et al, 2016). Это делает крайне актуальным разработку принципиально новых антимикробных лекарственных средств, обладающих не только биоцидной активностью, но и способностью к иммуномодуляции и к стимуляции процессов саногенеза (Kulikov et al, 2012).
В связи с этим особый интерес представляют природные катионные и анионные
полисахариды, такие как хитозан. Известно, что аминополисахарид хитозан (2-амино-2-
дезокси--D-глюкан, ХТЗ) обладает не только антибактериальной,
противовоспалительной и ранозаживляющей активностью, но и выраженным
иммунотропным действием (Майгуров и др., 2011; Patrulea et al, 2015).
В медицинской практике при лечении воспалительных заболеваний пародонта (ВЗП) и ран различной этиологии (ожогов, трофических язв, пролежней) широко применяются композиции, включающие в свой состав аскорбат хитозана - соль ХТЗ с аскорбиновой кислотой (Барахтенко и др., 2008; Булкина и др., 2015; Wang et al, 2010). Выбор аскорбиновой кислоты (АК) в качестве органического лиганда в составе солей с ХТЗ обусловлен её способностью определять нормальное течение репаративных процессов за счёт стимуляции пролиферации фибробластов и синтеза коллагена (Staudte et al, 2010; An et al, 2015).
Однако соль аскорбата ХТЗ образована двумя оптически активными химическими
соединениями. ХТЗ проявляет оптическую активность вследствие наличия асимметрично
замещённых атомов углерода в глюкопиранозных циклах макромолекул.
Асимметрический атом углерода в фурановом кольце молекулы АК обусловливает существование двух оптических диастереомеров, называемых L- и D-изоформами. При химическом синтезе АК, как правило, получается рацемат – смесь равных количеств L- и D-изоформ. В этой связи логично ожидать, что препараты, содержащие АК в виде смеси L- и D-изомеров, могут существенно различаться своими фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами, что не может не отразиться на эффективности проводимого лечения. Поэтому само существование явления стереоизомеризма лекарственных веществ инициировало развитие отдельного направления исследований, целью которых является сравнение эффективности и безопасности, как отдельных изомеров, так и их рацемической смеси (Смирнова и др., 2012; Campo et al, 2009; Testa, 2015). Вопрос о влиянии хиральности АК на биологическую активность препаратов на основе L- и D-аскорбатов ХТЗ остаётся практически не изученным.
Степень разработанности проблемы.
Перспективность использования препаратов на основе ХТЗ в качестве
антимикробных средств подтверждается многочисленными сообщениями о широком
спектре биоцидного действия этого аминополисахарида - в частности,
антибактериального (Шиповская и др., 2008; Raafat et al, 2008; Куликов и др., 2013, 2014; Wu et al, 2014), противовирусного (Smith et al, 2014) и фунгицидного (Tikhonov et al, 2006; Куликов и др., 2012). Высказано предположение, что биоцидное действие ХТЗ определяется наличием в его цепи многочисленных аминогрупп, положительный заряд которых обусловливает связывание полимера с анионными компонентами поверхностных структур клеток микроорганизмов (Диденко и др., 2005; Бондаренко и др., 2006; Куликов и др., 2010; Liu et al, 2004; Raafat et al, 2009).
Материалы на основе ХТЗ хорошо совместимы с живыми тканями человека и животных (Писаренко и др., 2003; Keong et al, 2009;), биорезорбируемы (Семенов, 2012), проявляют противовоспалительную (Майгуров и др., 2006, 2011; Зудина и др., 2013; Yang et al, 2010; Casettari et al, 2014), антитоксическую (Иванушко и др., 2009) и
иммунотропную (Алексеева и др., 2006; Zaharoff et al, 2007; Simard et al, 2009; Muzzarelli et al, 2010; Heffernan et al, 2011;) активности, а также способность стимулировать процессы ранозаживления и регенерации тканей (Байтюкалов и др., 2005; Достовалова и др., 2006; Федосов и др., 2015; Bonferoni et al, 2014;), что делает их крайне востребованными при создании различных ранозаживляющих средств (Жоголев и др., 2001, 2003; Пестов и др., 2006; Гафуров и др., 2008; Власов и др., 2010; Алексеева и др., 2012; Shi et al, 2006; Ji et al, 2014; Tang et al, 2016). Показана высокая терапевтическая эффективность препаратов, содержащих аскорбат ХТЗ, при лечении различных инфекционных и воспалительных заболеваний (Большаков и др., 2010; Иванов, 2013; Булкина и др., 2013; Wang et al, 2010).
Очевидно, что на этапе разработки лекарственных средств необходим сравнительный анализ терапевтической активности индивидуальных стереоизомеров. Установление особенностей действия стерических изоформ позволит выявить перспективные направления создания новых или совершенствования уже известных лекарственных препаратов.
Цель и задачи исследования.
Целью исследования явилось сравнение эффективности антимикробного и репаративно-регенеративного действия диастереомеров аскорбата хитозана. Задачи:
-
Установить характер оптической активности водных растворов L- и D-аскорбатов хитозана.
-
Сравнить in vitro биоцидные свойства L- и D-аскорбатов хитозана в отношении грампозитивных и грамнегативных микроорганизмов.
-
Изучить влияние L- и D-аскорбатов хитозана на динамику заживления экспериментальных ран на модели белых мышей и крыс.
-
Оценить действие гидрогелей L- и D-аскорбатов хитозана на модели воспалительных заболеваний пародонта.
Научная новизна.
Впервые представлены результаты комплексного динамического исследования биологических свойств солей хитозана и диастереомеров аскорбиновой кислоты.
Впервые доказана зависимость антимикробной активности аскорбатов хитозана от хиральности органического лиганда в составе соли в отношении референс-штаммов Escherichia coli 113-13 и Staphylococcus aureus 209-P.
Впервые установлено, что гидрогель D-аскорбата хитозана обладает более выраженными ранозаживляющими свойствами по сравнению с L-аскорбатом хитозана при обработке экспериментальных ран различной этиологии.
Показано снижение числа видов пародонтогенной микрофлоры при воздействии L- и D-аскорбатов хитозана. Впервые доказано, что D-аскорбат хитозана способствует более быстрому купированию клинических признаков воспалительного процесса в пародонте при лечении воспалительных заболеваний пародонта, чем L-аскорбат хитозана.
Теоретическая и практическая ценность.
Полученные данные по биологической активности солей хитозана с хиральным органическим лигандом будут востребованы при создании более совершенных фармацевтических материалов, в полной мере отвечающих требованиям врачей и позволяющих преодолевать такие нежелательные процессы как инфицирование ран, генерализация воспаления, формирование патологических рубцов и др. Показана высокая эффективность местного применения гидрогеля на основе D-аскорбата хитозана в качестве ранозаживляющего и противовоспалительного средства при лечении ран и ВЗП.
Внедрение в практику.
Материалы диссертации используются в учебном процессе (в лекциях и
практических занятиях) кафедры микробиологии и физиологии растений ФГБОУ ВО
«Саратовский национальный исследовательский государственный университет
им. Н. Г. Чернышевского» и кафедры микробиологии, биотехнологии и химии ФГБОУ ВО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н. И. Вавилова».
Положения, выносимые на защиту:
-
Антибактериальная активность водных растворов D-аскорбата хитозана в экспериментах in vitro превышает таковую у водных растворов L-аскорбата хитозана.
-
Гидрогель D-аскорбата хитозана обеспечивает более высокие темпы заживления ожога IIIБ у крыс в ранние сроки раневого процесса по сравнению с гидрогелем L-аскорбата хитозана.
-
При аппликации гидрогеля D-аскорбата хитозана на десну лиц, страдающих хроническим генерализованным катаральным гингивитом и хроническим генерализованным пародонтитом легкой степени, противовоспалительный эффект выше, чем в случае применения гидрогеля L-аскорбата хитозана.
Степень достоверности и апробация работы.
Высокая степень достоверности результатов обеспечена использованием
стандартных биологических, микробиологических, молекулярно-генетических, клинико-
лабораторных методов исследований и методов статистической и математической
обработки данных. Все исследования выполнены на аттестованном современном
оборудовании биологического факультета и отдела высокомолекулярных соединений
ОНИ НС и БС ФГБОУ ВО «Саратовский национальный исследовательский
государственный университет имени Н.Г. Чернышевского», ветеринарной клиники
ФГБОУ ВО «Саратовский ГАУ», консультативной поликлиники кафедры
терапевтической стоматологии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России, ЦКП «Симбиоз» ФГБУН ИБФРМ РАН.
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на следующих научных конференциях и форумах: 19-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология – наука XXI века», Пущино, 20 - 24 апреля 2015 г.; Научно-практическая конференция молодых учёных Presenting Academic Achievements to the World, Saratov, March 30 - 31, 2015; Всероссийская молодежная конференция «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине», Саратов, 10 - 12 ноября 2015 г.; 20-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 18 - 22 апреля 2016 г.; VIII Всероссийская конференция молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 26 – 30 сентября 2016 г.
Работа является самостоятельным трудом соискателя. Анализ литературы по теме диссертации, определение цели и задач исследования, планирование, выбор методов и дизайна исследования выполнены лично автором.
Публикации.
Основное содержание диссертационной работы отражено в 9 публикациях, из которых 3 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ, 6 публикаций в сборниках, трудах и материалах Всероссийских и международных научных конференций.
Структура и объем диссертации.