Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 14
1.1 Общая характеристика микроскопических грибов 14
1.2 Грибковые заболевания – микозы 18
1.2.1 Классификация микозов 18
1.2.2 Классификация микромицетов - возбудителей микозов 20
1.2.2.1 Условно-патогенные грибы 21
1.2.2.2 Первичные патогены, вызывающие поверхностные микозы 24
1.2.3 Этиология и заболеваемость первичными микозами 24
1.2.4 Связь микозов с экологическими и социальными условиями 28
1.3 «Синдром больного здания» 31
1.4 Аспергиллезы и их возбудители - грибы рода Aspergillus 33
1.4.1 Таксономия и номенклатура аспергилл 33
1.4.2 Идентификация грибов рода Aspergillus 35
1.4.3 Факторы патогенности грибов рода Aspergillus 36
1.4.4 Поверхностные аспергиллезы 44
1.4.4.1 Эпидемиология и клинические проявления поверхностных аспергиллезов 44
1.4.2.1 Стратегия лечения поверхностных микозов кожи 46
2 Материалы и методы 53
2.1 Выделение и идентификация грибов Aspergillus niger 53
2.2 Материалы и среды для культивирования микроорганизмов 54
2.2.1. Используемые в работе фураноны 54
2.2.2 Питательные среды 54
2.3 Методы исследований физиологии аспергилл 57
2.3.1 Определение параметров роста и спорообразования микромицетов 57
2.3.2 Оценка влияния ионов тяжелых металлов на рост и спорообразование 57
2.3.3. Определение ферментативной активности изолятов 58
2.3.4 Хроматографический анализ органических кислот, синтезируемых микромицетами 60
2.3.5 Оценка антихолинэстеразной активности изолятов A.niger 61
2.4 Оценка генотоксических свойств метаболитов грибов 61
2.5 Определение чувствительности A.niger к противогрибковым препаратам 62
2.6 Оценка чувствтительности изолятов A. niger к фуранонам 63
2.7 Оценка влияния РНКаз на рост микромицетов 63
2.8 Статистическая обработка данных 64
3 Результаты 65
3.1 Характеристика физиологических особенностей урбанистических и клинических изолятов микромицетов рода Aspergillus 65
3.1.1 Спектр штаммов A. niger, выделенных от больных поверхностными микозами и из урбанистических экониш 65
3.1.2 Параметры роста изолятов А. niger 67
3.1.3 Спорообразование клинических и урбанистических штаммов A.niger, культивируемых при различных температурах 72
3.1.4 Влияние солей меди на скорость роста и спорообразование клинических и урбанистических изолятов A.niger 74
3.2 Биохимическая активность изолятов Aspergillus 77
3.2.1 Протеолитическая активность 77
3.2.2 Выявление способности к гемолизу 78
3.2.3 Выявление липаз у изолятов A.niger 78
3.2.4 Амилолитическая активность 80
3.2.5 Детекция целлюлазной активности изолятов 81
3.2.6 Проявление кератиназной активности изолятов A.niger 82
3.3. Биосинтез органических кислот при культивировании изолятов A.niger 84
3.4 Влияние изолятов A.niger на активность холинэстеразы 86
3.5 Генотоксический потенциал экзометаболитов Aspergillus 86
3.6 Фунгицидное действие антимикотиков на клинические и урбанистические изоляты A. niger в зависимости от температуры их культивирования (280 и 370С) 87
3.7 Фунгицидное действие исследуемых соединений на изоляты A.niger 94
3.7.1 Чувствительность штаммов A. niger к действию фуранонов 94
3.7.2 Антимикотическая активность РНКаз 96
4 Обсуждение результатов 98
- Этиология и заболеваемость первичными микозами
- Стратегия лечения поверхностных микозов кожи
- Параметры роста изолятов А. niger
- Обсуждение результатов
Этиология и заболеваемость первичными микозами
В структуре поверхностных микозов кожи (ПМК) преобладают дерматофитии, которые занимают второе место после пиодермий (гнойное поражение кожи, возникающее в результате внедрения в неё стафило- и стрептококков) [Соколова и др., 2015]. Нередко ПМК называют «болезнями цивилизации» [Разнатовский и др., 2003].
По данным ВОЗ микозы кожи встречаются у 20% человек. Среди поверхностных микозов кожи 1/3 часть случаев составляет микоз стоп [Соколова и др., 2011]. Как отечественные, так и зарубежных исследования сообщают о преобладании микозов стоп (МС) и онихомикоза среди ПМК. Повсеместно отмечается увеличение количества микозов стоп. В РФ с 2002 по 2006 г. заболеваемость микозами стоп и кистей выросла на 3,9% [Кубанова и др., 2008], частота встречаемости МС продолжает расти: так, в 2017 году только в Краснодарском крае прирост заболеваемости МС составил 15,4% [Глумзин и др., 2018]. Ряд зарубежных авторов также сообщают о неблагополучной ситуации с МС. В Европе у каждого третьего пациента, обратившегося к дерматологу регистрируется микоз стоп и онихомикоз [Schmid-Wendtner et al., 2008]. Согласно данным российских дерматологов, МС встречается у 8–20% взрослого населения, при этом мужчины болеют в 2 раза чаще, чем женщины, а частота встречаемости этого заболевания увеличивается среди людей пожилого и старческого возраста [Степанова, 2011; Котрехова, 2005]. Так среди людей старше 60 лет 40% поражены этим недугом [Корсунская и др., 2018]. Микозы кожи и ногтей негативно влияют на жизнь больных, резко снижают качество жизни [Бурова и др., 2015] и оказывают негативное воздействие на трудоспособность больных: чувство стыда связанное с дефектом кожи может приводить к развитию психогенных расстройств, что в свою очередь способствует снижению работоспособности [Бедриковская, 2009].
Дерматофиты, дрожжеподобные и плесневые грибы могут являться возбудителями микозов кожи и её придатков. С течением времени изменялась их роль в патогенезе МС и онихомикозов. Ранее с конца ХХ в. и до первого десятилетия XXI в. среди возбудителей онихомикозов и МС преобладали дерматофиты. В настоящее время одни исследователи указывают на лидирующее значение дерматофитов, а другие наоборот отмечают снижение роли дерматофитов на фоне роста возбудителей дрожжевой и плесневой флоры. В РФ доля T. rubrum в структуре возбудителей МС снизилась до 65,2% наряду с увеличением значения дрожжеподобных грибов рода Candida (34,8%) и плесневых грибов (6,3%) [Разнатовский и др., 2003; Соколова и др., 2014].
Многие дерматофитии обычно переносятся «грибками стоп», в основном Trichophyton rubrum, Т. mentagrophytes и Epidermophyton floccosum [Сергеев и др., 2002]. Каждый человек постоянно теряет тончайшие чешуйки кожи, которые при МС могут содержать грибные гифы. Грибок может развиваться не сразу. Достаточно часто, споры оседают на обуви, одежде, дожидаясь условий способствующих развитию инфекции (влажность, тепло). Такие условия часто возникают между пальцами ног, где и развивается большинство первичных очагов эпидермофитий стопы. Зараженные грибками Malassezia furfur чешуйки кожи могут переноситься на постельное белье, одежду, на другие части тела. При обработке голыми руками почвы возможно развитие «микроспории садовников», вызываемой Microsporum gypseum.
Несмотря на имеющиеся достижения в области изучения микозов кожи и её придатков, эти заболевания не утратили своего значения, так как примерно 20% населения планеты до сих пор страдает от микозов стоп [Потекаев и др., 2006; Соколова и др., 2014].
В соответствии с последними рекомендациями комиссии ВОЗ по терминологии нозологических форм заболеваний и их возбудителей, МС определяются по родовому названию возбудителя. При этом ряд традиционно употребляемых терминов был изменен. Вместо термина «эпидермофития» введен термин «эпидермомикоз», вместо «дерматофития» – «дерматомикоз», вместо «трихофития» – «трихомикоз» [Соколова и др., 2016], что порождает серьезные затруднения. В соответствии с рекомендациями ВОЗ к трихомикозам, помимо трихофитии, должны относиться и рубромикоз, вызываемый T. rubrum, и эпидермомикоз, обусловленный T. mentagrophytes var. interdigitale. Термином «эпидермомикоз» можно обозначать только МС, причиной возникновения которого является Epidermophyton inguinale. Доля этого возбудителя в эпидемиологии МС минимальна. В то же время имеются публикации, в которых к эпидермомикозам относят эпидермофитию стоп, руброфитию, трихофитию, фавус и микроспорию, сопровождающиеся воспалительной реакцией вследствие проникновения токсинов гриба в эпидермис и дерму [Мурзина, 2012]. В данной классификации критерием является не родовое название возбудителя, а глубина его проникновения в кожу. Кроме того, отдельно выделяются трихомикозы (трихофития, микроспория, фавус), поражающие волосы. Следует отметить, что в международной классификации болезней 10-го пересмотра (МКБ-10), по-прежнему, используются старые названия – дерматофития стоп и кистей, эпидермофития паховая, дерматофитии неспецифические и т.д.
В последние годы в России для обозначения грибкового поражения кожи стоп в большинстве изданий по дерматовенерологии и микологии используется обобщенный термин «микоз стоп» (tinea pedis). Он введен в соответствии с классификацией МКБ-10 и применяется только для дерматофитий. Оценить частоту регистрации поражения стоп другими возбудителями по данным официальной статистики практически невозможно. Эти данные можно получить в периодической печати, где публикуются статьи отечественных и зарубежных ученых, занимающихся исследованиями в области микологии [Ilkit et al., 2014; Бурова и др., 2015].
Стратегия лечения поверхностных микозов кожи
Своевременное обнаружение микромицетов, оценка особенностей течения заболевания и прогнозирование его развития необходимы для дальнейшей разработки перспективной стратегии лечения аспергиллезов кожи и её придатков. При проведении лечения, для предотвращения массового роста заболеваемости, в свою очередь необходимо учитывать, что больные являются потенциальными источниками распространения инфекции. Обязательное проведение дезинфекции обуви, носков, перчаток и других предметов одежды контактирующих с пораженным участком, значительно повышает эффективность лечебно профилактических мероприятий при онихомикозах и дерматомикозах.
Отсутствие единого подхода к классификации микозов кожи порождает трудности, в выборе наиболее эффективных антимикотиков при лечении микозов стоп. Каждая нозологическая форма МС имеет свои варианты течения. Они отличаются индивидуальными клиническими особенностями, требующими специфического подхода к выбору тактики лечения [Бурова, 2014; Рукавишникова, 2003; Степанова и др., 2004]. В настоящее время только 67% пациентов с микозами стоп и 83% с онихомикозами кистей успешно излечиваются. Этиологическое излечение при онихомикозах стоп наблюдается у 46%, полное – у 33% пациентов; при онихомикозах кистей – у 71% и 67% соответственно. Однако уже в течение года 47 % больных с онихимикозами стоп и 25% с онихомикозами кистей отмечается рецидив заболевания. Таким образом, результативность терапии поверхностных микозов является невысокой [Гудкова, 2006].
Часто лечение микозов стоп может осложняться сопутствующими заболеваниями, так примерно у 30% пациентов с дисгидротическо экссудативной формы МС регистрируется присоединение вторичной пиодермии, затрудняя терапию микозов [Гладько и др., 2006; Белоусова и др., 2011; Havlickova et al., 2008]. Взаимодействие грибов и пиококков способствует более глубокому проникновению микромицетов в кожу. Грибы в свою очередь за счет нарушения трофики и целостности кожных покровов увеличивают шансы инфицирования бактериями. При интертригинозной форме микоза стоп соотношение микромицеты/бактерии меняется в сторону последних, что в свою очередь способствует усилению воспалительной реакции в очаге [Тарасенко, 2006; Пашинян, 2009]. МС являются актуальной проблемой при рожистом воспалении нижних конечностей [Bitnum, 1985; Boonchai et al., 2003; Roujeau, 1999].
Среди пациентов с данным заболеванием микозы стоп и онихомикзы встречаются у 72–91% [Салимова и др., 1996]. Наиболее часто среди больных с рецидивирующим рожистым воспалением нижних конечностей выделяют T. rubrum (96% случаев) и C. albicans (44% случаев). При этом мнения авторов по поводу влияния микоза стоп на степень риска развития рожистого воспаления значительно расходятся, так первые считают МС значительным фактором риска [Haneke, 1999; Пак, 2009], другие не придают ему значимость в развитии заболевания [Gupta, 2003].
Немаловажным фактором способствующим развитию микозов является лечение антибиотиками, гормонами, а также цитостатическими, химиотерапевтическими и других препаратов, что в свою очередь может приводить к развитию хронических микозов кожи и к неудачам в проведении противогрибковой терапии [Соколова и др., 2011]. Например, среди пациентов получающих иммуносупрессивную терапию онихомикоз регистрировался у 24% больных [Tuchinda et al., 2006].
Иммунная недостаточность играет значительную роль не только в заражении микромицетами при микозах кожи и её придатков, но также в развитии рецидивов заболевания [Tosti et al., 2005]. Недаром микозы стоп и онихомикозы являются дерматологическими маркерами ВИЧ/СПИДА [Ilkit et al., 2014; Da Silva et al., 2014; Ермак, 1999; Рахманова 2000; Хаитов и др., 1994].
Таким образом, видно, что выбор эффективной стратегии лечения микозов должен строиться с учетом микромицета-возбудителя, иммунного состояния пациента, сопутствующих заболевание и других немаловажных факторов. При лечении микозов может использоваться системная, местная или комбинированная терапия. Для назначения наиболее эффективной стратегии лечения при онихомикозах принято пользоваться Клиническим Индексом Оценки Тяжести Онихомикозов Сергеева (КИОТОС). Предложенный в 1999 году Сергеевым А.Ю. единый критерий клинической оценки онихомикозов позволяет оценить течение заболевания и отразить её на шкале оценки тяжести, а также рекомендовать схему и длительность лечения, адекватную значению индекса.
Внешняя среда оказывает немаловажное влияние на эффективность работы противогрибковых препаратов. Из окружающей среды грибы получаю макро- и микроэлементы необходимые для их роста и развития. К числу необходимых грибам микроэлементов относятся соли меди, являющиеся важной составной частью таких оксидаз, как лакказа (полифенолоксидаза), оксидаза аскорбиновой кислоты, оксидаза цитохрома a3, уратоксидаза, в свою очередь участвующих в этапах восстановления нитратов [Бузолёва и др., 2013; Winkelmann et al., 1995]. Окружающая среда также может быть источником неблагоприятного воздействия: температура, кислотность, токсины и др. Устойчивый рост темноокрашенных грибов (Aspergillus, Alternaria) в местах повышенного содержания ионов тяжелых металлов свидетельствует об их устойчивости к действию тяжелых металлов [Марфенина и др., 2007]. Накопление тяжелых металлов может приводить к угнетению и даже гибели чувствительных микроорганизмов, или, наоборот, стимулировать развитие устойчивых видов, оказывая влияние на численность микроорганизмов в почве [Баязитова и др., 2015; Марфенина, 2005].
В настоящее время для лечения микозов, в том числе и аспергиллезов существует большое количество лекарственных препаратов, которые различаются друг от друга по своему составу, происхождению, химической структуре, а также механизму действия и спектру активности. Среди препаратов природного происхождения для лечения микозов наиболее часто используются полиены (амфотерицин В, нистатин), среди антимикотиков синтетического происхождения азолы, обладающие более высокой избирательностью действия и меньшей токсичностью, и аллиламины, оказывающие в основном фунгицидное действие (тербинафин) [Сбойчаков, 2008]. Эффективность действия антимикотиков осложняется их токсичностью по отношению к человеку [Мюллер и др., 1995; Сбойчаков, 2008]. В связи с этим приобретает актуальность проблема создания новых фунгицидов, мишенью действия которых могут служить структуры специфичные только для грибов (хитин, маннан-глюкановый комплекс и др.). На фоне поиска новых противогрибковых препаратов приобретает актуальность изучение факторов патогенности микромицетов, как возможных мишеней для действия фунгицидных препаратов.
В современном мире все большую значимость приобретает борьба с дермато- и онихомикозами [Hoog et al., 2000; Кукушкина и др., 2013]. И хотя поверхностные микозы достаточно широко распространены, эффективность излечения от данного заболевания составляет всего 60% [Dixon et al, 1996]. Назрела необходимость разработки новых принципов лечения ПМК и онихомикозов за счет избирательного применения новых, малотоксичных, возможно комплексных лекарственных форм, обладающих эффективностью доставки к очагам грибковой инфекции.
Своевременное обнаружение микромицетов, оценка особенностей течения заболевания и прогнозирование его развития необходимы для дальнейшей разработки перспективной стратегии лечения и предотвращения роста массовой заболеваемости микозами кожи и её придатков.При этом необходимо направленно подавлять факторы патогенности аспергилл, к которым относятся экзоферменты деструкции органических полимеров и секретируемые токсины. Вследствие принадлежности аспергилл к эукариотам, задача избирательного подавления их физиологический активности особенно сложна и требует новых подходов для решения.
Таким образом, детальная характеристика различных штаммов аспергилл и систематизация факторов, влияющих на их вирулентность, чрезвычайно актуальна и определенно внесет вклад в разработку методов борьбы с аспергиллезами.
Параметры роста изолятов А. niger
Как известно, патогенные микромицеты характеризуются способностью расти в широком диапазоне температур. Часто встречаются термофильные виды [Соколова и др., 2011], растущие при температурах до 500С, и сохраняющиеся длительное время в высушенном и замороженном состояниях. Важным свойством патогенных грибов является также способность их выживать во внутренней среде человека при 370С [Paisley et al., 2005]. В связи с изложенным нами проведен сравнительный анализ роста изолятов A. niger, выделенных от больных поверхностными микозами, в процессе их культивирования при комнатной температуре (28оС) и температуре тела человека (37оС).
Исследование роста клинических изолятов при 370С в течение 3, 4, 5 дней показало, что у пяти изолятов (К-210, К-212, К-13, К-110, К-111), вызывающих онихомикоз, и двух (У-21, У-22), выделенных из слухового прохода, наибольшая скорость роста наблюдалась на третий день культивирования. При температуре 280С высокая скорость роста была показана для более широкого ряда клинических изолятов A. niger, таких как: К-25- возбудитель микоза стоп; К-25, К-26, К-27, К-210, К-213, К-113 - возбудители онихомикоза; К-113, К-114, К-29, К-27- возбудители микоза кожи кистей; У-22 – возбудителя отомикоза. Отмечено, что у возбудителей отомикоза (У-15, У-16, У-17) как при 280С, так и при 370С скорость роста является низкой (Рис.10).
Через четыре и пять дней культивирования клинических изолятов при 370С и 280С не было выявлено существенных различий в скорости их роста (Рис. 11, 12). Таким образом, наиболее чувствительными к температуре внешней среды являются изоляты гриба после их трехдневного роста.
В связи с установленным фактом зависимости скорости роста клинических изолятов как от температуры, так и от продолжительности их культивирования представляло интерес определить рост урбанистических изолятов A. niger при тех же температурных условиях в зависимости от времени их культивирования (Рис.14). Отмечено, что на третий день выращивания при 370С и 280С все урбанистические изоляты демонстрировали слабый рост (Рис. 13), который, однако, на пятый день культивирования возрастал на 50% и находился у разных изолятов примерно на одинаковом уровне (Рис. 15).
Таким образом, существенных различий в скорости роста колоний клинических изолятов A. niger, культивируемых при 280С и 370С, не было выявлено, в отличие от урбанистических изолятов, у которых на 5-ый день инкубации скорость роста возрастала на 50%. В связи с полученными данными важно рассмотреть способность к спорообразованию изолятов, растущих при 280С и 370С.
Обсуждение результатов
Микромицеты рода Aspergillus являются гиалогифомицетами или, более точно, лейкогифомицетами (название связано с аналогией морфотипа спороносцев и формы наконечника садовой лейки), и относятся к классу сумчатых грибов (Ascomycetes), семейства Aspergillaceae [Билай и др., 1970; Елинов, 2001; Мюллер и др., 1995]. В окружающей среде разные виды Aspergillus выполняют функцию редуцентов, разлагают отмершие органические субстраты, образуя пектиназы, амилазы, протеазы и некоторые другие экзоферменты. Они участвуют в круговороте С, N и других элементов и способны расти в широком диапазоне температур. Микромицеты рода Aspergillus, могут быть причиной возникновения различных грибковых заболеваний: поверхностных микозов (микозы кожи, онихомикозы, отомикозы), аспергиллезов и широкого диапазона хронических сапрофитных и аллергических состояний.
Вторичные заражения человека аспергиллами могут быть связаны с их присутствием в воздухе жилых помещений, в частности в «больных» зданиях, обсемененных микромицетами. При этом степень риска во многом зависит от того, какие именно микромицеты развиваются внутри помещения, так как разные виды могут представлять различную степень потенциальной опасности для человека начиная с аллергии и заканчивая глубокими микозами. Наряду с такими возбудителями аспергиллезов как A. fumigatus, A. flavus, A. terreus, A. versicolor, A. nidulans и др., мицелиальный гриб A. niger – один из наиболее часто встречающихся возбудителей поверхностных микозов в РТ. В работе использовали 44 клинических штамма A. niger, выделенных у пациентов с дерматомикозами и отомикозами в г. Казани Р.Т. Все культуры микромицетов использованные в работе были получены на базе Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии (табл. 3). После выделения чистой культуры возбудителя проводили идентификацию микромицетов по культурально-морфологическим признакам и при помощи анализа 18S РНК.
Согласно нашим данным, полученным в 2000 - 2013 годы урбанистические изоляты A. niger наиболее часто выделялись в пробах, взятых со стен жилых помещений современной постройки, что могло вызвать проблемы со здоровьем у людей, проживающих или работающих в этих зданиях. Вместе с тем, физиолого-биохимические свойства различных урбанистических изолятов и выделенных нами клинических штаммов A. niger исследованы недостаточно и не дают представления об их дифференциальном вкладе в патогенез инфекции, тогда как определение степени патогенности этих штаммов аспергилла может оказаться важным для идентификации видов микромицетов, ранней диагностики заболеваний, а также для подбора адекватной противогрибковой терапии.
В проведенной работе дана физиолого-биохимическая характеристика клинических штаммов A. niger, выделенных нами от пациентов, страдающих поверхностными микозами (микозы кожи стоп, кистей, онихо- и отомикозы), а также изолятов из природных антропогенных экониш.
Способность грибов рода Aspergillus вступать во взаимодействие с восприимчивым макроорганизмом, ведущим в итоге к развитию инфекционного процесса (заболевания), прежде всего, обуславливается его патогенностью. Общепринято, что к факторам патогенности микроорганизмов относятся их такие адаптивные свойства, как способность расти и развиваться при температурах 37оС и выше. Нами был проведен сравнительный анализ роста клинических и урбанистических изолятов A. niger, при комнатной температуре (28оС) и температуре тела человека (37оС). Измерение радиальной скорости роста штаммов в течение пяти дней показало, что в группе клинических и урбанистических изолятов A. niger не выявлено существенных различий в скорости роста (Рис. 10 - 15).
Клинические штаммы A. niger, культивируемые при 370С демонстрировали более раннее и активное спорообразование, чем при 280С (Рис. 16). Урбанистические изоляты демонстрировали слабый рост на третий день выращивания при 370С и 280С, который, однако, на пятый день культивирования возрастал на 50% и находился у разных изолятов примерно на одинаковом уровне. Также повышение температуры до 370С снижало общее количество образовавшихся спор у 67% урбанистических изолятов, но их способность вызывать инфекции сохранялась, о чем свидетельствует их мицелиальный рост из единичной споры на 5-ые сутки культивирования и образование спор.
Известно, что медь как один из тяжелых металлов, входит в состав средств, используемых для дезинфицирующей обработки зданий (медный купорос, бордоская жидкость). С учетом изложенного испытывали влияние меди на клинические и урбанистические изоляты A.niger. Единственным штаммом, переносящим высокие концентрации меди (1 мл 1М раствора СuSO4) оказался возбудитель отомикоза - штамм У-15 (Рис. 17). При снижении концентрации солей меди вдвое спорообразование у 30% проросших штаммов прекращалось. Среди урбанистических изолятов способность к образованию колоний и спор сохранялась только у штамма W-1.
Полученные в результате исследований данные подтверждают имеющиеся сведения о возможности использования меди в качестве средства для создания новых фунгицидных или фунгистатически препаратов, а механизмы термотолерантности могут быть перспективными мишенями для разработки противогрибковых препаратов.
На основе статистического анализа 11% урбанистических и 36% клинических изолятов было установлено интенсивное образование спор клиническими штаммами A.niger при 370С, что является прямым подтверждением высокой контагиозной активности, способностью их к расселению и захвату новых мест обитания. У клинических штаммов в отличие от урбанистических обнаружена не только более высокая скорость спорообразования, но и протеолитическая активность; что в целом демонстрирует большую агрессивность клинических изолятов A.niger в сравнении с урбанистическими штаммами.
Патогенные свойства аспергилл определяются их гетеротрофностью и как необходимость – синтезом ферментов, которые помогают им заселять самые разнообразные органические и неорганические субстраты, а также активно колонизировать живые организмы [Мюллер и др., 1995]. В связи с изложенным мы провели сравнительный анализ активности секретируемых ферментов у клинических и урбанистических изолятов A.niger.
Протеолитическую активность выделеных микромицетов измеряли по гидролизу ЧСА (человеческого сывороточного альбумина). У клинических изолятов протеолитическая активность более выражена по сравнению с урбанистическими штаммами, что свидетельствует о более высокой способности клинических микромицетов разрушать ЧСА. (Рис. 20)
Биодеградирующая способность микромицетов A.niger в отношении жилых зданий, обусловленная липолитической активностью, одновременно является одним из факторов вирулентности для человека и может оказаться полезной для оценки их общей патогенной активности. В результате измерения липолитической активности клинических и урбанистических штаммов A. niger, культивируемых при 280С и 370С, была выявлена их способность гидролизовать эфиры жирных кислот. При этом для урбанистических изолятов показан более высокий уровень липолитической активности, чем для клинических, культивируемых при 280С и 370С. (Рис. 21 и 22) Возможно, это связано с тем, что в отличие от урбанистических, клинические штаммы имеют более широкий спектр питательных субстратов, в результате чего невысокий уровень липолитической активности для них является достаточным
Амилолитическая активность микромицетов. как правило, связана с расщеплением углеводов, в частности, гетерополисахаридов, входящих в состав гликопротеинов либо углеводов в составе зерновых культур. Нами было показано, что урбанистические штаммы при 280С обладали более высоким уровнем амилолитической активности, чем при 370С., когда она полностью ингибируется. Ферментативная активность клинических штаммов при 37оС сохраняется, что может быть обусловлено их способностью расщеплять углеводы в составе крови. (Рисунок 23 и 24).
Изучение целлюлазной активности A. niger показало, что штаммы, выделенные из природных источников и штаммы, полученные в результате забора клинического материала, демонстрируют различный уровень проявления данной активности. Наибольшей целлюлазной активностью (4-5 баллов) обладали штаммы, полученные от пациентов с подозрением на онихомикоз и отомикоз, в то время как у урбанистических изолятов целлюлазная активность варьировала от 5 до 1 балла. (Табл. 4) Логично предположить, что урбанистические штаммы должны были иметь более высокую целлюлазную активность, чем клинические патогенные микромицеты. Очевидно, регистрируемая у клинических штаммов величина целлюлазной активности демонстрирует уровень индуцируемой активности, а не конституционной. К тому же урбанистические штаммы имеют более широкий спектр питательных субстратов и потому для их развития достаточно незначительного уровня целлюлазной активности.
Кератиназную активность клинических и урбанистических изолятов A. niger определяли при культивировании их на минеральной среде, содержащей волосы, которые на 78% состоят из белка альфа — кератина, обогащенного микроэлементами и витаминами, на 15% из воды, на 6% из липидов [Шарова, 2010]. Клинические штаммы демонстрировали хороший мицелиальный рост на дне колбы, а также было отмечено обрастание волос мицелием. Наблюдаемый интенсивный рост клинических штаммов A. niger, который сопровождался деструкцией волоса, свидетельствует о том, что в группе клинических изолятов были выявлены штаммы с кератиназной активностью. (рис. 25).