Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .11
1.1.Вирус гепатита Е .11
1.1.1.Общая характеристика вируса гепатита Е 11
1.1.2. Структура и организация генома 12
1.1.3. Белки вируса гепатита Е и их функции
1.1.3.1. Неструктурные белки .13
1.1.3.2. Капсидный белок ВГЕ 16
1.1.1.1. Белок ОРС3 ВГЕ
1.1.4. Репликация вируса гепатита Е 19
1.1.5. Генетическое разнообразие Таксономия вируса гепатита Е .21
1.1.6. Таксономия вируса гепатита Е .24
1.2. Эпидемиология гепатита Е 26
1.2.1.Гепатит Е на гиперэндемичных территориях .26
1.2.2. Гепатит Е на эндемичных территориях .28
1.2.2.1. Частота обнаружения маркеров ВГЕ-инфекции в эндемичных по ВГЕ странах .30
1.2.2.2. Гепатит Е в Российской Федерации 32
1.3. Диагностика ВГЕ-инфекции 34
1.3.1.Динамика маркеров ВГЕ-инфекции 34
1.3.2. Выявления анти-ВГЕ класса IgM 36
1.3.3.Выявление анти-ВГЕ класса IgG 36
1.3.4 Выявление РНК вируса гепатита Е 37
1.3.5. Интерпретация маркеров инфицирования ВГЕ 40
Глава 2. Материалы и методы .41
2.1 Материалы исследований 41
2.2 Методы исследований 44
2.2.1. Определение чувствительности выявления РНК ВГЕ 44
2.2.2. Определение чувствительности теста для выявления анти-ВГЕ Ig .45
2.2.3. Разработка вторичного стандарта анти-ВГЕ 46
2.2.4. Определение авидности антител к ВГЕ класса IgG .47
2.3.Статистические методы 47
Глава 3.Результаты
3.1. Чувствительность выявления РНК ВГЕ 48
3.2. Определение чувствительности теста для выявления анти-ВГЕ IgG .51
3.3. Определение диагностической значимости определения авидности антител к вирусу гепатита Е класса IgG 53
3.4. Разработка вторичного стандарта анти-ВГЕ 57
3.5. Определение концентрации анти-ВГЕ IgG в клинических образцах с использованием вторичного стандарта анти-ВГЕ 60
Глава 4. Обсуждение 61
Выводы 68
Практические рекомендации .69
Библиографический список литературы
- Репликация вируса гепатита Е
- Определение чувствительности выявления РНК ВГЕ
- Определение диагностической значимости определения авидности антител к вирусу гепатита Е класса IgG
- Определение концентрации анти-ВГЕ IgG в клинических образцах с использованием вторичного стандарта анти-ВГЕ
Введение к работе
Актуальность и степень разработанности темы
Гепатит Е (ГЕ) является инфекционным заболеванием, вызываемым небольшим безоболочечным РНК-содержащим вирусом, принадлежим к роду Hepevirus семейства Hepeviridae. ГЕ — одна из наиболее серьёзных и актуальных проблем здравоохранения в развивающихся, а также во многих развитых странах. По оценкам ВОЗ, в развивающихся странах ежегодно фиксируется более 3 миллионов симптоматических случаев ГЕ и 70 000 смертей, вызванных этой инфекцией.
Вирус гепатита Е (ВГЕ) широко распространен в странах тропического пояса, где по сути занимает экологическую нишу вируса гепатита А, вызывая вспышки и спорадические случаи заболевания преимущественно среди молодых взрослых. Накопление сведений о циркуляции вируса гепатита Е (ВГЕ) и случаях ассоциированного с ним заболевания на территориях, ранее считавшихся неэндемичными (страны умеренного климата, в том числе Россия), сделало актуальным надзор за данной инфекцией и включение маркеров ГЕ в систему дифференциальной лабораторной диагностики гепатитов. С 2013 года ГЕ является официально регистрируемой в России нозологической формой. Основными маркерами ГЕ, применяемыми для его лабораторной диагностики, являются антитела к ВГЕ (анти-ВГЕ) классов IgM и IgG, а также вирусная РНК, выявляемая в образцах стула и/или сыворотки крови у инфицированных лиц. Как правило, период виремии при ГЕ (то есть присутствие РНК ВГЕ в крови) составляет не более двух недель на начальных этапах инфекции. Выделение вируса с фекалиями, и, соответственно, обнаружение РНК ВГЕ в стуле, происходит, как правило, на протяжении всей инфекции. Выявление анти-ВГЕ IgM свидетельствует об острой или недавно перенесенной ВГЕ-инфекции, тогда как присутствие анти-ВГЕ IgG без антител класса М указывает на перенесенную ранее
инфекцию. Считается, что анамнестические анти-ВГЕ IgG сохраняются на протяжении многих лет и обеспечивают пожизненных иммунитет против повторного инфицирования.
Выявление анти-ВГЕ и РНК ВГЕ важно не только для адекватной
диагностики ГЕ, но и для эпидемиологического надзора за инфекцией. Анти-
ВГЕ IgG определяют в сероэпидемиологических исследованиях для оценки
широты прослойки лиц, встречавшихся с данным возбудителем. Выявление
РНК ВГЕ у заболевших и последующий анализ генетического материала
вируса необходимы для установления источников инфекции и возможных
путей передачи ВГЕ. Однако проведенный ранее анализ чувствительности и
специфичности разных тестов на анти-ВГЕ методом иммуноферментного
анализа (ИФА) показал существование значительных различий между
диагностикумами. Именно эти различия, как считается, являются причиной
противоречивых результатов сероэпидемиологических исследований,
выполненных на одних и тех же территориях. Аналогичным образом различаются и молекулярные тесты для выявления РНК ВГЕ. Очевидно, именно отсутствие национальных стандартов диагностики ГЕ является причиной противоречивого характера сведений об эпидемиологии ГЕ на разных территориях.
Разработка надежной системы диагностики ВГЕ-инфекции является
важной задачей в РФ и других странах, как для теоретической вирусологии,
поскольку расширяет современные представления о распространенности
ВГЕ-инфекции, так и для практического здравоохранения: это помогает
обнаружить группы риска и потенциальные источники инфицирования.
Стандартизованный диагностический инструментарий является ключевым
моментом для получения ответов на следующие нерешенные вопросы:
продолжительность сохранения и динамика концентрации анти-ВГЕ у
пациентов с реконвалесценцией; обеспечивает ли долгое сохранение антител
IgG иммунную защиту организма от повторного инфицирования ВГЕ и
какова протективная концентрация анти-ВГЕ? Для стандартизации
диагностики ГЕ Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) были выпущены два референсных материала – Стандарт анти-ВГЕ, разработанный Национальным институтом биологических стандартов и контролей (NIBSC) и Стандарт РНК ВГЕ, разработанный Институтом Пауля Эрлиха. Тем не менее, применяемые в настоящее время в России и за рубежом серологические и молекулярные тесты, как правило, не валидированы относительно единого стандарта.
Вышеизложенное определяет актуальность темы диссертации.
Цель исследования
Целью диссертационного исследования является создание подходов к стандартизации системы лабораторной диагностики гепатита Е.
Задачи исследования
-
С помощью стандартов ВОЗ определить чувствительность тестов, применяемых в РФ для серологической и молекулярной диагностики ГЕ.
-
Разработать национальный стандарт выявления анти-ВГЕ и провести его валидацию относительно международного стандарта ВОЗ.
-
Определить распределение концентраций анти-ВГЕ IgG у серопозитивных лиц и установить долгосрочную динамику изменения этого показателя у реконвалесцентов.
-
Оценить диагностическую значимость определения индекса авидности анти-ВГЕ у серопозитивных лиц.
Научная новизна работы
Впервые получен национальный количественный стандарт анти-ВГЕ, валидированный относительно стандарта ВОЗ. Впервые на представительной выборке клинических образцов установлены различия в концентрации анти-ВГЕ и их авидности в зависимости от стадии инфекции (острый гепатит Е,
ранние реконвалесценты, давно перенесенная инфекция). С помощью
Первого Международного стандарта Всемирной организации
здравоохранения для РНК вируса гепатита Е определена аналитическая чувствительность тест-системы для выявления РНК ВГЕ и установлена четкая зависимость чувствительности детекции от объема анализируемого образца.
Теоретическая и практическая значимость и внедрение
результатов
В результате проведенных исследований получены инструменты для
стандартизации лабораторной диагностики гепатита Е и
эпидемиологического надзора за данной инфекцией – молекулярный тест для
выявления РНК ВГЕ с чувствительностью в диапазоне 125-250 МЕ/мл,
данные по аналитической чувствительности коммерческого ИФА-теста для
выявления анти-ВГЕ, и отечественный стандарт анти-ВГЕ с концентрацией 5
МЕ/мл. Установлены величины концентраций анти-ВГЕ и показатели
авидности антител у пациентов в зависимости от стадии инфекции (острый
гепатит, ранние реконвалесценты, давно перенесенная инфекция).
Полученные результаты продемонстрировали, что тест на авидность позволяет более чем в 80% случаев дифференцировать давно перенесенную ВГЕ-инфекцию от случаев ранней реконвалесценции.
Методология и методы диссертационного исследования
В основе выполненного исследования лежит количественное и
полуколичественное определение анализируемых маркеров (анти-ВГЕ IgG,
РНК ВГЕ) относительно стандартного референсного материала
(Международные стандарты ВОЗ для анти-ВГЕ и РНК ВГЕ, соответственно). Для этого были использованы серологические и молекулярно-биологические методы детекции. Полученные результаты подвергнуты статистическому анализу с использованием стандартных статистических методик.
Положения, выносимые на защиту
1. Аналитическая чувствительность испытанных отечественных
серологических и молекулярных тестов для диагностики гепатита Е,
определенная относительно референсных материалов ВОЗ и выраженная в Международных Единицах, равна или превышает соответствующие показатели зарубежных аналогов.
-
Разработан национальный референсный материал для антител к вирусу гепатита Е, позволяющий проводить оценку аналитической чувствительности диагностических тестов и выражения полученных в них результатов в Международных Единицах.
-
Определены средние величины и разброс значений концентрации анти-ВГЕ в клинических образцах. Установлено, что среди лиц, недавно встречавшихся с ВГЕ, концентрация анти-ВГЕ в два раза выше по сравнению с теми, кто давно перенес инфекцию.
4. Продемонстрирована диагностическая значимость определения
авидности анти-ВГЕ класса IgG при тестировании образцов сыворотки крови
от пациентов с разными стадиями ВГЕ-инфекции (острый гепатит Е, ранние
реконвалесценты, давно перенесенная инфекция).
Степень достоверности работы определяется представительностью и
достоверностью анализируемых выборок, проведением экспериментальной
части работы на сертифицированном оборудовании с применением системы
внешних и внутренних контролей, использованием валидированного
референсного материала; полученные данные согласуются с
опубликованными экспериментальными данными по теме диссертации. В
работе использованы современные методики сбора и обработки информации,
полученные данные основаны на применении обоснованных
представительных выборочных совокупностей.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции молодых ученых Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова (апрель 2013 г., г. Москва).
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 статьи - в рецензируемых журналах, входящих в Перечень рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Репликация вируса гепатита Е
Неструктурные белки ВГЕ кодируются ОРС1. Данный кодируемый участок начинается сразу же после 5 конца некодируемого участка (NCR). ОРС1 кодирует полипептид, состоящий из 1693 аминокислот (АК), участвующий в репликации вируса и процессинге белка [59]. ОРС1 содержит несколько предполагаемых функциональных доменов [65] (рис. 2), в том числе домен метилтрансферазу для кэпирования 5 конца геномной РНК вируса [124]; “Y” домен с неизвестной функцией; домен папаинподобную цистеинпротеазу (PCP); участок, богатый пролином, содержащий гипервариабельную область (HVR); домен X с неизвестной функцией, находящийся после PCP домена; геликазный домен (Hel) и домен РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), который отвечает за репликацию вируса [16]. Домен Met является первым функциональным домен 5 конца ОРС1[48]. В полипротеине ОРС1 молекулярной массой 110 кДа, экспрессирующемся в бакуловирусной системе, была обнаружена активность как домена гуанин-7-Met, так и гуанилтрансферазы. Участок кэп имеет решающее значение для инфекционных свойств вируса, только кэпированная геномная РНК является патогенной у низших приматов [59]. Было показано, что очищенный рекомбинантный белок Hel ВГЕ обладает С-фосфатазой, которая может катализировать первый этап формирования участка кэп [111]. Это означает, что Hel домен белка ВГЕ является активным и может быть вовлечен в синтез 5 конец кэпированного участка РНК ВГЕ.
Было высказано предположение, что домен PCP находится в ОРС1 ВГЕ [116], однако окончательные доказательства трансляционного и посттрансляционного процессинга полипротеина ОРС1 до сих пор отсутствуют. Когда ОРС1 экспрессируется в клетках млекопитающих, два потенциальных продукта посттрансляционного процессинга молекулярной массой 107 кДа и 78 кДа наблюдаются только после длительного инкубационного периода [175]. Однако разрушение протеазного каталитического центра в области ОРС1 PCP домена не влияет на процессинг продуцируемого белка.
Недавно была исследована деконъюгационная активность очищенного рекомбинантного белка, который содержит домены метилтрансферазы и папаинподобную цистеинтрансферазу (Мэтт-PCP) ОРС1. Рекомбинантный белок MetT-PCP ВГЕ обладает деконъюгационной активностью [110]. .Остается неясным, функционирует ли полипротеин ОРС1 как один белок с несколькими функциональными доменами или, при условии, что белки небольшие, они функционируют независимо друг от друга.
Вирусная RdRp содержит восемь консервативных мотивов (мотивы I VIII), которые похожи на RdRp других вирусов с геномом, представленным РНК положительной полярности. RdRp локализована в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) из клеток, экспрессирующих рекомбинантный белок RdRp [117]. Это означает, что ЭПР может быть вовлечен в процесс репликации ВГЕ. HVR был выявлен в ОРС1 ВГЕ, он перекрывает богатую пролином последовательность, которая находится между N-терминальным концом X домена и С-терминальным концом предполагаемого PCP домена [33]. HVR изменяется как по длине, так и по последовательности между различными генотипами ВГЕ [158]. Было показано, что ВГЕ может переносить небольшие делеции в HVR, и аминокислотные остатки в этой области являются необязательными для инфекционных свойств вируса [158]. Однако репликация делеционных мутантов HVR была заметно снижена в клетках Huh7, и аналогичное снижение репликации ВГЕ наблюдалось в тестах с HVR делеционными мутантами птичьего ВГЕ, которые были испытаны на клетках куриной печени [159]. Последовательности HVR функционально взаимозаменяемы между различными генотипами ВГЕ по отношению к вирусной репликации и инфекционности в условиях in vitro; однако, были также обнаружены и генотип-специфические различия в HVR, определяющие активность репликации [159]. Это говорит о том, что, в то время как малые делеции в HVR не оказывают существенного влияния на инфекционные свойства вирусов, HVR может влиять на репликацию ВГЕ за счет взаимодействия с вирусным агентом и/или организмом хозяина.
Капсидный белок ВГЕ кодируется ОРС2, его длина составляет 660 АК, молекулярная масса примерно 72 кДа. Белок капсида имеет типичную аргинин-богатую последовательность сигнального пептида и три потенциальных N-связанных сайта гликозилирования [133]. В условиях in vitro была обнаружена экспрессия белков капсида разной величины [193]. Капсидный белок ОРС2 участвует в сборке частиц ВГЕ и его взаимодействии с клетками хозяев. Белок капсида содержит потенциальный сигнал локализации в ЭПР на своем N-терминальном конце; в то время как белок проникает в ЭПР происходит ретротранслокация некоторой части белка в цитоплазму [185]. Большая часть капсидного белка, экспрессирующегося в клетках млекопитающих, гликозилируется. Процесс гликозилирования очень важен для формирования инфекционных свойств вирусных частиц [82]. Белок капсида также связывается с геномной РНК ВГЕ[184] и может играть роль в процессе сборки вируса. Он взаимодействует с клетками хозяина и связывается с белком теплового шока 90 (HSP90) [219], глюкозорегулирующим белком 78 (Grp78) [215] и гепарин-сульфатными протеогликанами (HSPGs) [107]. Было показано, что HSPGs может служить рецептором для облегчения проникновения ВГЕ в клетки хозяина, в то время как Grp78 или HSP90 могут быть вовлечены во внутриклеточный транспорт. Недавно было показано, что три аминокислотные мутации (F51L, T59A и S390L) в капсидном белке ВГЕ приводят к ослаблению вирулентных свойств вируса
Определение чувствительности выявления РНК ВГЕ
Тем не менее, накоплены свидетельства о том, что ГЕ может наблюдаться у людей, которые никогда не были в гиперэндемичных районах, то есть ГЕ также рассматривается как автохтонная болезнь. Первые два случая автохтонного ГЕ были описаны в США [46]. В странах умеренного климата бессимптомные носители, выделяющие вирус с фекалиями, могут быть источником заражения. Большинство случаев автохтонной инфекции, вызванной вирусом ГЕ 3 и 4 генотипов, описано у мужчин старше 40 лет [161].
Исследования, проведенные в Центре по контролю и профилактике инфекционных болезней (CDC) США, позволили выявить 26 подтвержденных случаев ГЕ, диагностированных в течение 7 лет, среди 154 американских пациентов [101]. При этом 15 больных не выезжали за границу. Таким образом, доля автохтонной ВГЕ-инфекции составила 9,7%. Генотипическое исследование позволило обнаружить ВГЕ 3 генотипа в сыворотке крови 8 пациентов. Случаи ГЕ, вызванного вирусом этого же генотипа, были зарегистрированы также в других странах американского континента - Аргентине, Боливии, Бразилии, Уругвае и Венесуэле [144, 137]. Частота местного заражения ВГЕ у пациентов с острым гепатитом неясной этиологии варьирует от 1,6% в Бразилии до 30% - в Венесуэле [101].
В последние годы доказано наличие резервуара ВГЕ среди животных. ГЕ, вызываемый 3 и 4 генотипами вируса, является зоонозной инфекцией. Носителями ВГЕ могут быть различные домашние и дикие животные. Экспериментальное инфицирование обезьян свиным штаммом ВГЕ оказалось успешным, что подтвердило зоонозный характер инфекции. Свинья рассматривается как основной резервуар ВГЕ во многих странах. Распространенность маркеров ВГЕ-инфекции более высока среди работников свиноферм [55, 76] и мясокомбинатов [2], а также ветеринаров [127]. Случаи зоонозной передачи вируса 3 и 4 генотипов были зарегистрированы в ряде промышленно развитых стран, после употребления сырого или недостаточно термически обработанного мяса и печени свиней [130,176]. Исследования P.G. Halbur [85] показали, что частичная термическая обработка мяса, а также его замораживание не приводят к снижению способности ВГЕ вызвать инфекцию у свиней. Исследователи в США выделили РНК ВГЕ из свиной печени, продаваемой в магазинах [72].
Спорадические случаи ГЕ, вызванные вирусом 3 и 4 генотипов, распространены также в Китае, Японии, Корее и Тайване [115].
Частота выявления маркеров ВГЕ-инфекции, вызванной вирусом 3 и 4 генотипов среди различных групп населения в Европейских странах может достигать 52,5%. Низкий уровень распространенности ( 4%) зарегистрирован в Греции, Нидерландах, Италии и северной Франции. В то же время высокий уровень распространенности ( 16%) был зарегистрирован в Великобритании, Дании, Молдове и юго-западе Франции [32, 108].
Некоторые исследования показали высокую распространенность антител к ВГЕ (анти-ВГЕ) в эндемичных регионах (32,9% - в Дании, 11,8% в Испании, 16,6% - во Франции и 18% - в США) [105]. Эти результаты, скорее всего, зависят от возраста обследованных лиц, контакта людей с домашними животными, кулинарными обычаями населения и чувствительности диагностических тест-систем, которые были использованы [127] (Таблица 1). Популяционные исследования распространенности ВГЕ-инфекции в европейских странах дали следующие результаты: в Нидерландах в течение 3 зо лет при обследовании 1027 человек выявлено 4,4% случаев ГЕ [90], на юго-западе Англии - 3,3% (838 обследованных в течение 3 лет) [48], в Финляндии - 10,5% (97 обследованных в течение 9 лет) [109]; в Венгрии - 9,6% (1203 обследованных в течение 6 лет) [172]; в Испании - 10,8% (277 обследованных в течение 6 лет) [58] и в Италии - 55,7% (52 обследованных в течение 7 лет) [36]. Изучение распространенности ВГЕ-инфекции проводилось также в Восточном Китае. Среди 12052 человек разных возрастов анти-ВГЕ были обнаружены в 2073 (7,20%) образцах сывороток крови пациентов. Частота выявления анти-ВГЕ значительно увеличивалась с возрастом: от 7,92% - у детей в возрасте до 10 лет до 21,48% - среди лиц старше 60 лет. Распространенность была выше также среди людей, проживающих в сельской местности, по сравнению с городскими жителями [6].
Определение диагностической значимости определения авидности антител к вирусу гепатита Е класса IgG
Всего было проанализировано 97 образцов сыворотки крови пациентов для измерения авидности антител IgG к вирусу гепатита E. В первую группу из 51 образца сыворотки крови, содержащих анти-ВГЕ IgG, но не содержащих анти-ВГЕ IgM, были включены сыворотки крови от жителей Свердловской области, проходивших в начале 1980-х годов срочную воинскую службу в Афганистане (гиперэндемичном по ГЕ регионе), и имевших риск встречи с ВГЕ более 30 лет назад (n = 16). Также в эту группу образцов были включены сыворотки крови от условно здорового населения Московской области (n=34) и Хабаровского края (n=1), в которых при проведении популяционных сероэпидемиологических исследований были выявлены анти-ВГЕ.
Во вторую группу из 46 образцов сыворотки крови, положительных по анти-ВГЕ классов IgG и IgM, были включены 8 образцов от пациентов с острым ГЕ, заболевших в 2009 году во Владимирской области при вспышке данной инфекции, а также 1 образец от пациента с ГЕ из Белгородской области. Также в эту панель образцов были включены 26 сывороток от лиц с серологическими маркерами текущей или недавно перенесенной ВГЕ инфекции, выявленными на территории Белгородской области. Результаты эпидемиологических исследований, проведенных недавно в данном регионе, продемонстрировали широкую циркуляцию ВГЕ на этой территории, и позволяют рассматривать Белгородскую область как территорию, эндемичную по ВГЕ-инфекции [157]. Дополнительно в панель образцов были включены сыворотки крови от лиц, у которых при проведении сероэпидемиологических исследований были выявлены анти-ВГЕ IgG и IgM (4 образца из Московской области, 2 образца из Свердловской области, 5 образцов из Хабаровского края)
В первой панели образцов (анти-ВГЕ IgG+/IgM-) были выявлены 4 (7,8%) образцов с индексом авидности ниже 20%, что может указывать на недавнее инфицирование вирусом гепатита Е. Авидность была выше 40% в 43 (84,3%) образцах данной панели, что свидетельствует о давности инфицирования ВГЕ. В 4 (7,8%) случаях авидность антител IgG была промежуточная (между 20 и 40%) (Рисунок 9). Инструкцией производителя используемой нами тест-системы при интерпретации результатов не предусмотрено наличие такого промежуточного значения, и все случаи с индексом авидности выше 20% рекомендуется рассматривать как давно перенесенную инфекцию. Среднее значение авидности в образцах первой панели составило 65,6% с диапазоном значений от 10% до 100% (Рисунок 10а).
Во второй панели сывороток крови (анти-ВГЕ IgG+/IgM+) из 46 образцов в 6 (13%) показатели авидности составили менее 20%. У одного пациента авидность антител IgG к ВГE составляла 1%, этот образец был также положительным по РНК ВГЕ. Уровень авидности выше 40% был в 34 (73,9%) образцах, в 6 (13%) образцах авидность составила 20-40% (Рисунок 9). Среднее значение авидности в образцах второй панели составило 53,4%. Распределение показателей индекса авидности для образцов второй группы приведено на рисунке 10б. В группе 2 среднее значение индекса авидности было ниже, чем в группе 1, на 12,2% (P 0.05). Образцы с индексом авидности до 20% и 20-40% в группе 2, т.е. среди лиц с предположительно недавно перенесенной ВГЕ-инфекцией, встречались почти в 2 раза чаще по сравнению с группой 1, т.е. у лиц с давно перенесенной ВГЕ-инфекцией (13% против 7,8%; P 0.05).
Распределение значений индекса авидности анти-ВГЕ в группах. А. Образцы сыворотки крови от лиц, давно перенесших инфекцию (анти-ВГЕ IgG+/IgM-); Б. Образцы сыворотки крови от больных ГЕ или недавних реконвалесцентов (анти-ВГЕ IgG+/IgM+). 3.4. Разработка вторичного стандарта анти-ВГЕ
Для приготовления вторичного стандарта анти-ВГЕ был выбран образец донорской плазмы, положительный по анти-ВГЕ IgG в тесте ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G с высоким значением ОП (более 2,5). Образец был нереактивным в лицензированных тестах на антитела к ВГС, антитела к ВИЧ, HBsAg, антитела к HBc; негативным по РНК ВИЧ, РНК ВГС, ДНК ВГВ. Из осветленной центрифугированием плазмы были приготовлены 500 аликвоты объемом 0,5 мл. Из трех аликвот готовили три идентичных серии разведений в стерильной воде: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128. Каждую серию разведений независимо тестировали на анти-ВГЕ IgG с использованием набора реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G» с использованием в качестве количественного стандарта разведений стандарта ВОЗ для анти-ВГЕ в концентрациях 0,25 МЕ/мл, 0,5 МЕ/мл, 1 МЕ/мл, 5 МЕ/мл и 10 МЕ/мл. На основании полученной калибровочной кривой в каждом разведении тестируемой серии определяли концентрацию анти-ВГЕ в МЕ/мл.
Оставшиеся 497 аликвот лиофилизировали. Три лиофилизированных образца восстанавливали стерильной водой до объема 0,5 мл и готовили из них три идентичных серии разведений в стерильной воде: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128. Каждую серию разведений независимо тестировали на анти-ВГЕ IgG, аналогично образцам до лиофилизации с использованием набора «ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G» и рассчитывали концентрацию анти-ВГЕ в каждом образце относительно калибровочной кривой стандарта ВОЗ.
Определение концентрации анти-ВГЕ IgG в клинических образцах с использованием вторичного стандарта анти-ВГЕ
Нами была проведена оценка диагностической значимости определения авидности анти-ВГЕ класса IgG при тестировании образцов сыворотки крови от пациентов с разными стадиями ВГЕ-инфекции. Для измерения авидности антител IgG использовали новый тест «DS-EIA-Anti-HEV-G-Avidity» (НПО «Диагностические системы»), согласно которому низкий индекс авидности образца ( 20%) позволяет предположить острую инфекцию или повторную встречу с ВГЕ, а высокий индекс авидности образца ( 20%) позволяет предположить, что встреча с вирусным агентом была давно. Исследования проводились на двух подготовленных нами панелях образцов – первая представляла собой образцы сыворотки крови от лиц, давно перенесших ВГЕ-инфекцию, и имевших только анти-ВГЕ IgG, а вторая – образцы сыворотки крови, положительные по анти-ВГЕ классов IgG и IgM, полученные от недавних реконвалесцентов и пациентов с ГЕ. Полученные результаты продемонстрировали, что тест на авидность позволяет более чем в 80% случаев дифференцировать давно перенесенную ВГЕ-инфекцию от случаев ранней реконвалесценции. Сходным образом, в исследовании, проведенном C.Bigaillon с соавторами, степень авидности анти-ВГЕ IgG определяли в 132 образцах сыворотки крови, в том числе от 39 пациентов с острым ГЕ. Индекс активности был высоким ( 60%) у пациентов с перенесенной инфекцией (n=16) или поликлональной активацией (n=3), но был низким ( 40%) у 20 из 39 пациентов с острой инфекцией (51,3%). Из 93 образцов сыворотки крови, положительных по анти-ВГЕ IgM, но отрицательных по РНК ВГЕ, индекс активности 40% был выявлен в 77 (82,8%) [28].
В другом серологическом исследовании иммунного ответа на инфицирование ВГЕ, проведенном R.Bandal с соавторами среди 55 пациентов с острой ВГЕ-инфекцией, была показана низкая авидность анти-ВГЕ IgG (в среднем 25%) в острую фазу инфекции, и увеличение ее у всех пациентов выше 50% через 6 месяцев [26].
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что измерение авидности анти-ВГЕ класса IgG может быть использовано для диагностики ГЕ как дополнительный этап до постановки ПЦР. Учитывая, что виремия и выделение РНК ВГЕ с фекалиями наблюдается не у всех пациентов с острым ГЕ, а результаты определения анти-ВГЕ IgM могут быть ложноположительными, определение индекса авидности анти-ВГЕ IgG позволит получить дополнительную информацию для уточнения диагноза острого гепатита Е. Создание национальных референсных материалов для контроля качества проведения лабораторных исследований является важнейшей задачей для оптимизации диагностики инфекционных заболеваний. Диагностика гепатита Е не является исключением. Нами был разработан стандартный образец анти-ВГЕ IgG, валидированный относительно международного стандарта ВОЗ (NIBSC code: 95/584). Полученный вторичный стандарт представляет собой лиофилизированную донорскую плазму, негативную по маркерам ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С, и имеет концентрацию анти-ВГЕ, равную 5 МЕ/мл. Тестирование разведений данного стандарта показало линейность результатов определения анти-ВГЕ, совпадающую с линейностью результатов тестирования Международного стандарта ВОЗ. Таким образом, полученный вторичный стандарт анти-ВГЕ может применяться для оценки аналитической чувствительности выполняемых исследований и выражения полученных результатов в МЕ/мл. Измерение концентрации антител к ВГЕ класса IgG имеет также важное значение в процессе создания вакцины против данной инфекции, поскольку позволяет количественно оценить иммунный ответ организма и определить защитный титр IgG против вируса.
Важным представляется тот факт, что стандарт ВОЗ и разработанный нами вторичный стандарт продемонстрировали полное совпадение кривых в диапазоне от 0,25 МЕ/мл до 5 МЕ/мл на графике, построенном при откладывании значений оптической плотности (ОП) относительно концентрации антител. Это свидетельствует об идентичной специфичности антител, содержащихся в обоих стандартах, к используемому в тесте антигену, и подтверждает адекватность конвертации полученных для вторичного стандарта значений концентрации в МЕ/мл. Стандарт ВОЗ основан на сыворотке, полученной от пациента, инфицированного ВГЕ генотипа 1 [73], в то время как вторичный стандарт, созданный нами, содержит, по-видимому, антитела к ВГЕ генотипа 3. На это указывает распространенность ВГЕ генотипа 3 и отсутствие случаев циркуляции ВГЕ 1 генотипа на территории РФ и, в частности, в Белгородской области, где получен исходный материал для создания вторичного стандарта [7]. Эти данные подтверждают представление о том, что разные генотипы ВГЕ относятся к одному серотипу [213].
Применение валидированного относительно стандарта ВОЗ серологического теста позволяет проводить прямое сравнение с результатами, полученными в других тестах, имеющих такие же единицы измерения. С помощью разработанного стандартного образца анти-ВГЕ IgG, валидированного относительно международного стандарта ВОЗ, нами была определена концентрация анти-ВГЕ в образцах лиц с давно перенесенной ВГЕ-инфекцией, а также у недавних реконвалесцентов и пациентов с ГЕ. Исследования проводили с помощью тех же двух панелей образцов, что использовались для оценки степени авидности анти-ВГЕ IgG. Оказалось, что среди лиц, позитивных по IgG и IgM (т.е. недавно встречавшихся с ВГЕ), концентрация анти-ВГЕ в два раза выше по сравнению имеющими только IgG (12,5 МЕ/мл против 5,5). Сходные значения были получены в Великобритании при обследовании сывороток доноров крови – средняя концентрация анти-HEV IgG составила 5.0 МЕ/мл (от 0.3 до 45.4) в образцах, отрицательных по анти-ВГЕ IgM и имеющих высокий индекс авидности ( 50%) [25].
Таким образом, в результате проведенных исследований получены инструменты для стандартизации лабораторной диагностики гепатита Е и эпидемиологического надзора за данной инфекцией – молекулярный тест для выявления РНК ВГЕ с чувствительностью в диапазоне 125-250 МЕ/мл, данные по аналитической чувствительности коммерческого ИФА-теста для выявления анти-ВГЕ, и отечественный стандарт анти-ВГЕ с концентрацией 5 МЕ/мл, а также подтверждена диагностическая значимость теста для определения авидности анти-ВГЕ.