Введение к работе
Актуальность проблемы.В последние годы широкое распостране-
ние получил микробиологический метол защиты растений от вредных насекомых. В качестве производственного продуцента бактериальных инсектицидов используются, в основной,энтомопатогенные бактерии Bacillus thuringiensis. Отличительная особенность Вас. thuringiensis - способность продуцировать при споруляшш параспо-ральные кристаллы,токсичные для личинок чешуекрылых,жесткокрылых, двукрылых.Инсектициды на основе Вас. thuringiensis характеризуются узкой направленностью энтомоцидного действия и экологически безвредны.Основными инсектицидными факторами являются, эндотоксин и экзотоксин.определенную роль в развитии патологического процесса играют споры,которые вахни для сохранения вида во внешней среде и его циркуляции в естественных биоценозах. Коммерческие препараты бактериальных инсектицидов представляют собой смесь кристаллов и спор.Бактерии Вас.thuringiensis,кристаллический эндотоксин и споры - основные инсектицидные факторы - заслуживают всестороннего и детального исследования.Актуальность данной проблемы возрастает,если учесть,что в процессе применения биоинсектицидов на основе споро-кристаллических комплексов,в окружающую среду вносится большое количество спор и кристаллов.
В настоящее время проводится многоплановое изучение Вас.thuringiensis. Однако цитологические исследования,как база для нзуче-чения биологических свойств Вас.thuringiensis,не получили должного развития.к моменту начала наших исследований ультраструктурная организация Вас.thuringiensis была недостаточно изучена.Особенности споро- и кристаллообразования у ряда подвидов не были исследованы.Немногочисленные цитологические данные не позволяли установить связь таких важных для Вас.thuringiensis характеристик, как колониально-морфологическая изменчивость,способность к обмену генетической информацией и к адгезии со свойствами определенных
клеточных структур.В настоящее время насчитывается около зо разновидностей Вас.thuringiensis,различаюдихся по Н-антигену,культу-рально-биохиинческик свойствам и спектру энтомоцидной активности, эти признаки используются для дифференцировки подвидов.Однако в существующей классификации практически не используются цитологические критерии,а также данные по фагочувствительности и лизоген-ному статусу.выявление гаксономически значимых признаков имеет важное значение в связи с поиском природных штаммов для производства энтомоцидных препаратов.С учетом промышленного значения Вас.thuringiensis особую важность приобретает вопрос о фагах,как основной причине дефектных заводских операций.Сложность проблемы фаголизиса усугубляется постоянной сменой подвидов и штаммов , практикуемой при производстве средств завиты растений.Поэтому существовала необходимость изучения производственных фагов и анализа фаговой обстановки на заводах,без чего невозможно вести целенаправленное получение фагоустойчивых штаммов.
Фаги Вас.thuringiensis до настоящего времени не классифицированы, для их систематизации необходимо получение молекулярно-би-ологических характеристик,в том числе физико-химических параметров нуклеиновых кислот,не определенных для этой группы фагов.Все вышеизложенное послужилооснованием для проведения работы по характеристике бактерий Вас.thuringiensis,их фагов и взаимоотношений в системе фаг - клетка.
Цели и задачи исследования.Целью наших исследований явилось выявление структурно-функыионнальных особенностей вас. thuringiensis,разработка критериев для дифференцировки штаммов, а также молекулярно-биологическая характеристика фагов,их систематизация и анализ взаимоотношений с бактериями-хозяевами в связи с проблемой фаголизиса при производстве энтомоцидных препаратов.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие основные задачи исследования,включавшие электронноиикроскопи-ческое изучение динамики споро- и кристаллообразования у продуцентов энтомоиидных препаратов; электронномикроскопический анализ вегетативных клеток,спор,кристаллов ряда птаммов Вас.thuringiensis,а также их фагов и фаговой ДНК; выявление функциональной роли структурных элементов клеток и спор в связи с колониально-морфологической изменчивостью,процессами,связанными с переносом генетической информации и адгезией; создание коллекции фагов,выделенных из различных источников,изучение биологических и физико-химических свойств фагов и их взаимодействия с бактериями; установление родства фагов различного происхождения и природы производственного фаголизиса.
Научная новизна и практическая ценность. На клеточном и молекулярном уровне изучены свойства Вас.thuringiensis,связанные с биологией энтомопатогенных бактерий.Основные данные,полученные впервые,касаются строения и функции поверхностных структур вегетативных клеток и спор. У вегетативных клеток выявлены микрокапсула, структурирований слой (С-слой) клеточной стенки и единичные фимбрии.Обнаружены компоненты структуры клеточной стенки,способствующие обмену генетической информацией.Показано образование межклеточных мостиков при совместном культивировании Вас.thuringiensis и Вас.cereus,сопровождавшемся переносом плазмид кристаллообразования. Найдены различия в тонком строении окзоспорнума и покровов у подвидов Бас.thuringiensis.Впервые у Вас.thuringiensis обнаружены споровые выросты трех типов и изучено их тонкое строение. Показано, что у спор в зависимости от полвида доминирует определенный тип выростов.Показано,что споры обладают адгезивной способностью за счет трубчатых выростов,морфологически сходных с
пилями грамотрииательных бактерий.Найдены клстки-иишени (эритроциты морской свинки,цыпленка,крысы),позволившие выявлять адгезивно-активные итаммы Bac.thuringiensis с помощью реакции гемагглю-тинации (РГА).Методом солевой агрегации (МСА) и с помощью гексадекана показано,что выросты модифицируют поверхность споры, повышая Підрофобность и усиливая адгезивные свойства.
Выявлена корреляция между способностью вызывать РГА и адгезией к гидрофобным поверхностям и листьям.Предложена классификация подвидов Бас.thuringiensis,основанная на геыагглютшшруюией активности.обнаружение адгезивной способности у спор Bac.thuringiensis дало возможность представить взаимоотношения в системе растение - насекомое - знтомопатогсшше бактерии с учетом взаимодействия всех компонентов.Полученные данные позволили сделать вывод о том.что для выживания и проявления токсического действия Bac.thuringiensis эволюционно приспособлены структуры,которые могут обеспечить спорам первичный контакт с листьями или другими поверхностями для дальнейшего попадания в кишечник насекомого и прорастания.
В результате изучения большой коллекции фагов Bac.thuringiensis обнаружена их неоднородность по ультраструктурным и молеку-лярно-биологическим характеристикам.С учетом морфологических и физико-химических особенностей фаги разбиты на группы,куда вошли представители морфотипов А1,В1,В2,С1 и С2. Электронномикроскопи-ческое исследование днк,впервые,позволило обнаружить фаги Вас.thuringiensis, ДНК которых циркулярно пермутирована и имеет концевую избыточность.С помощью сайт-специфических рестриктаз изучена структура геномов вновь выделенных фагов.Многолетние исследования фагового фона на заводах-производителях средств защиты растений позволили выявить наиболее опасные для производства каждого энто-
моциаішго препарата фаги.Доказано экзогенное происхождение фагов, вызывающих фаголизис при производстве средств защиты растении.
Результаты изучения фагочувствительности "природных' изоля-тов показывают,что они не. отвечают всем технологическим требованиям, в том числе и фагоусгойчивости."Природные" штаммы могут служить лишь основой для дальнейших генетических экспериментов.Результаты исследований были использованы при создании штаммов-продуцентов средств защиты растений (Автор.свид.СССР N 1190566, 198 J; Автор.свил.СССР И 1412290,1988; Автор.свид.СССР,полох.решение от 25,09.1990).Работа выполнена в рамках темы 1891-6464-12 (номер гос.регистрации 0188007402) в лаборатории генетики энтомопатоген-ных бактерий ВНИИ Генетика.
Основные полотенца,выносимые на запиту.
-
Виду Вас.thuringiensis свойственна гетерогенность ультраструктурной организации эндоспор и кристаллов эндотоксина,связанная с принадлежностью к подвиду.
-
Вегетативные клетки Вас.thuringiensis обладают фкмбриями, структурированным слоем клеточной стенки я ыикрокапсулон, выявляемой у S-форм.
-
споры подвидов Вас.thuringiensis различаются по тонкой структуре экзоспориума,покровов,толщине кортекса.
-
споры различных подвидов вас.thuringiensis,за исключением подвида dendroliraus,обладают уникальными поверхностными структурами белковой природы - выростами.Имеются выросты трех морфологических типов: тубулярные.филаментоэные,цилиндрические. В зависимости от подвида у спор доминирует определенный тип выростов, функцией выростов является обеспечение спорам способности прикрепляться к различным поверхностяи.в том числе и к листьям,что необходимо для попадання в кишечник насекомого.
5. Подвиды Вас.thuringiensis (адгезивно-активные штаммы) обладают гемагглютинирующей активностью.Способность вызывать реакцию гемагглютинации может служить дополнительным признаком для внутривидовой ди$>ференинровки.
(,. Форма и тонкая структура кристаллов эндотоксина коррелируют с патотнпом.что может быть использовано для скрининга штаммов с определенным спектром энтомоиндного действия.
~>. Фаги вас. thuringiensis относятся к 5 морфологический ти-пам і А1 ,Б1,в;,Cl,С2).различаются по спектру литического действия и Физико-химическим параметрам ДНК.
к. Подвиды Вас.thuringiensis различаются по фагочувствктель-ности и особенностям лизогенного состояния.Природные иэоляты эн-томопатогенных бактерий не могут быть внедрены в производство без предварительной селекции по признаку фагоустойчивостк.
Апробация работы.Материалы диссертации доложены или представлены: на международной симпозиуме "Сборка пред&иологическнх и биологических структур".Москва,1979; XII Международном микробиологическом конгрессе.Мюнхен,1978: XI Всесоюзной конференции по электронной микроскопии,Таллинн,197 9; ХП Всесоюзной конференции по электронной микроскопии.Москва,1982; Всесоюзном совещании "Цитология микроорганизмов",Пушино,1984; Всесоюзном симпозиуме "Криогенные методы в электронной микроскопии".Пуиико,1985: XIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии,Звенигород,198S; Всесоюзной конференции "Проблемы создания и применения микробиологических средств зашиты растений".Велегож,1989; Международном симпозиуме "молекулярная биология Вас.thuringiensis".Сан-Франциско, 1991 .
Структура и объем работы.Настоящая диссертация состоит из 2-х томов (основная часть и приложение).она содержит 238 страниц
машинописного текста.В ней имеется обзор литературы,описание объ- . ектов и методов исследования,экспериментальная часть.общее заключение и выводы.результаты проиллюстрированы 236 микрофотографиями, 2 схемами,3 графиками,-27 таблицами.Список цитируемой литературы включает 282 публикации.