Содержание к диссертации
Введение
1. Цикл азота в почве 14
1.1.Фиксация молекулярного азота 15
1.1.1. Микроорганизмы, осуществляющие процесс биологической фиксации азота 15
1.1.2. Ферментный комплекс – нитрогеназа 24
1.1.3. Факторы, влияющие на процесс фиксации азота 27
1.2. Аммонификация 29
1.2.1. Микроорганизмы, осуществляющие процесс аммонификации...30
1.2.2. Факторы, влияющие на процесс аммонификации 30
1.3. Нитрификация 31
1.3.1.Автотрофная нитрификация 31
1.3.2.Микроорганизмы, осуществляющие процесс автотрофной нитрификации 32
1.3.3. Гетеротрофная нитрификация .33
1.3.4. Микроорганизмы, осуществляющие процесс гетеротрофной нитрификации 34
1.3.5. Факторы, влияющие на процесс нитрификации 34
1.4. Анаэробное окисление аммония (анаммокс) .36
1.5. Денитрификация
1.5.1. Биологическая денитрификация 38
1.5.2. Микроорганизмы, осуществляющие процесс денитрификации...41
1.5.3. Факторы, влияющие на процесс биологической
денитрификации 42
1.5.4. Ассимиляционная нитратредукция 43
1.5.5. Диссимиляционная редукция нитрата до аммония 43
2. Объекты и методы .46
2.1. Отбор проб и подготовка почвы .46
2.2. Постановка экспериментов .47
2.2.1. Определение актуальной и потенциальной активности азотфиксации .47
2.2.2. Определение числа КОЕ на безазотистой среде 48
2.2.3. Определение численности КОЕ аммонификаторов 49
2.2.4. Определение содержания аммонийного азота в почвах .49
2.2.5. Определение актуальной и потенциальной активности денитрификации 50
2.2.6. Определение дыхательной активности почв после внесения углерод-, азот- и фосфорсодержащих добавок .51
2.2.7. Оценка активности гидролиза флуоресцеин диацетата .55
2.2.8. Мультиреспираторный тест .56
2.2.9. ДГГЭ-анализ
2.2.10. Люминесцентная микроскопия стекол обрастания .61
2.2.11. Статистическая обработка результатов 62
3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Динамика актуальной и потенциальной активности азотфиксации 64
3.2. Динамика численности азотфиксаторов .67
3.3. Динамика численности аммонификаторов .71
3.4. Динамика содержания аммонийного азота в почве 75
3.5. Динамика актуальной и потенциальной активности денитрификации 76
3.6. Активность дыхания почв, при внесении углерод-, азот- и фосфорсодержащих добавок 85
3.7. Активность гидролиза флуоресцеин диацетата в образцах почв залежи и поля 101
3.8. Мультиреспираторный тест .102
3.9. Структурный анализ микробных сообществ на основе молекулярно-биологических методов (ДГГЭ – анализ) .106
3.10. Анализ количественных характеристик микробного роста 109
3.11. Оценка относительной роли грибов и бактерий в почвах залежи и обрабатываемого поля 110
Выводы .115
Список литературы
- Микроорганизмы, осуществляющие процесс биологической фиксации азота
- Определение числа КОЕ на безазотистой среде
- Динамика численности аммонификаторов
- Активность гидролиза флуоресцеин диацетата в образцах почв залежи и поля
Введение к работе
Актуальность темы. Нарастающие потребности интенсификации
сельскохозяйственного производства являются причиной масштабной и активной эксплуатации почв в аграрном секторе. Интенсивное возделывание почв агросистем, сопровождающееся мощным механическим и химическим воздействием, существенно модифицирует почвенное микробное сообщество (Leff et al., 2015; Sun et al., 2004) изменяя и даже нивелируя его роль в саморегуляции почвенной системы (Barrious, 2007). Поскольку большинство микроорганизмов, осуществляющих ключевые реакции глобальных циклов биогенных элементов, являются представителями почвенной микробиоты, сельскохозяйственная практика, несомненно, вносит изменения в интенсивность и направленность этих процессов (Acoste-Martinez et al., 2010). В первую очередь это касается этапов глобального цикла азота, которые протекают в почве (Hofman et al., 2004; Myrold, 2002). Структурно-функциональные характеристики физиологических групп почвенных микроорганизмов, участвующих в трансформации азота, являются отражением процессов, протекающих в почвенной системе (Bannert et al., 2011; Cheneby et al., 2010; Peralta et al., 2010), и могут служить источником важной информации о появлении и развитии деструктивных процессов в данной экосистеме.
Тесная взаимосвязь различных этапов цикла азота является причиной
необходимости проведения обширных сопряженных исследований для выявления
структурных или функциональных особенностей физиологических групп
микроорганизмов цикла азота. Вместе с тем, требуется постановка длительных
непрерывных экспериментов, направленных на изучение динамики составляющих его
процессов, и микроорганизмов, участвующих в его осуществлении. Даже на сегодняшний
день комплексные исследования в этой области, учитывающие данные особенности,
насчитывают лишь единичные работы. Еще реже встречаются исследования,
направленные на поиск индикаторов состояния почвенной экосистемы, опирающихся на
структурные или функциональные характеристики физиологических групп
азотфиксаторов, денитрификаторов или аммонификаторов. Неоднократное упоминание в научной литературе о том, что процессы денитрификации и азотфиксации, являющиеся связующими звеньями внутрипочвенного и глобального циклов азота, могут служить интегральными показателями состояния почвенной экосистемы, не сопровождается подробными рекомендациями относительно использования этих показателей в природоохранной, сельскохозяйственной практике, а также в целях почвенной ремедиации и т.п.
Цель диссертационной работы – изучение структурно-функциональных
особенностей микробных сообществ и отдельных физиологических групп
микроорганизмов, участвующих в процессах трансформации азота в почвах залежи и интенсивно возделываемого поля.
Задачи исследования:
-
Провести оценку динамики потенциальной и актуальной активностей процессов, являющихся интегральными показателями функционирования микробного сообщества в почвах залежи и интенсивно обрабатываемого поля.
-
Провести сравнительный анализ структурных характеристик микробных сообществ почв залежи и поля на основании результатов молекулярно-биологических исследований (ДГГЭ-анализ).
-
Провести сопряженную оценку динамики потенциальной и актуальной активностей процессов азотфиксации, денитрификации и аммонификации с учетом динамики численности соответствующих групп микроорганизмов в почвах залежи и обрабатываемого поля.
4. Оценить резистентность почвенных систем залежи и поля по специфическим
(азотфиксация, денитрификация) и интегральным (дыхание, гидролиз флуоресцеин
диацетата) показателям функционирования микробных сообществ.
5. Оценить спектры трофических возможностей микробных сообществ почв залежи и
поля по показателям мультиреспираторного теста.
Научная новизна. Впервые для серых лесных почв умеренного климата,
находящихся под влиянием интенсивной агротехнологии, изучена длительная
ежесуточная динамика активности и численности физиологических групп
микроорганизмов, участвующих в цикле азота, и проведен сравнительный анализ структурно-функциональных особенностей физиологических групп азотфиксаторов, денитрификаторов и аммонификаторов, а также микробных сообществ в целом, для двух почвенных систем: интенсивно возделываемой с длительным применением минеральных удобрений и необрабатываемой – залежной. Предложен метод анализа результатов ДГГЭ с применением классического экологического подхода оценки биоразнообразия к распределению дискретных таксономических единиц – риботипов. Сопряженное использование микробиологического, биохимического и структурного анализов в отношении динамических характеристик почвенного микробного сообщества и отдельных физиологических групп микроорганизмов – участников цикла азота в почве – выявило глубокие изменения в почвенной системе, находящейся под воздействием интенсивной обработки, которые не выявляются при использовании современных эколого-
микробиологических походов к формализации данных лишь на основе оценки устойчивости экосистем.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования
углубляют представления о динамике процессов цикла азота в почвах типа серые лесные с
различной историей развития почвенных экосистем; представляют наглядную
информацию о структурно-функциональных особенностях как отдельных
физиологических групп микроорганизмов, принимающих участие в трансформации азотсодержащих веществ почвы, так и микробного сообщества в целом; являются надежным основанием для выбора формальных индикаторных показателей, используемых для экологической оценки устойчивости почвенных систем.
Количественные оценки динамики активности процессов азотфиксации и денитрификации могут служить основой для разработки документации природоохранного характера и при оценке воздействия на окружающую среду в зоне распространения серых лесных почв.
Материалы исследования могут быть использованы при проведении почвенно-микробиологического мониторинга, при оценке почв в качестве источника углекислого газа и закиси азота, а также при моделировании климатических изменений в регионах умеренного климата с распространением серых лесных почв; при моделировании процессов цикла азота в ненарушенной и нарушенной почвенных экосистемах.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на XX, XXI, XXII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва 2013, Москва 2014, Москва 2015); Всероссийском конкурсе программы «Лифт в будущее» (Моска, 2013); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии, и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2014); 5-м Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, литературный обзор, описание объектов и методов исследований, экспериментальные результаты и их обсуждение, выводы и список литературы (144 источника, из них 84 – зарубежные). Материалы диссертации изложены на 136 страницах текста, содержат 35 иллюстраций, 7 таблиц.
Микроорганизмы, осуществляющие процесс биологической фиксации азота
Представители животного и растительного мира не могут черпать азот непосредственно из атмосферы Земли. Такой способностью обладают только представители доменов Вacteria и Archaea. Приблизительно 175 Тг азота фиксируется ежегодно в наземных экосистемах азотфиксирующими прокариотическими микроорганизмами, в то время, как только около 10 Тг азота фиксируется посредством атмосферных химических процессов. Микроорганизмы, усваивающие молекулярный азот, называются диазотрофами (Fisher, 1994; Zahran, 1999; Myrold, 2002; Orr et al., 2011). В современной научной литературе нет единого мнения относительно группирования азотфиксирующих микроорганизмов. Как правило, авторы подразделяют все многообразие диазотрофов на две (симбиотические и ассоциативные) или три (симбиотические, ассоциативные и свободноживущие) группы (Умаров и др., 2007; Bothe et al., 2007). Симбиотические азотфиксаторы Наиболее изученными к настоящему времени являются симбиотические взаимодействия бактерий семейства Rhizobiaceae с растениями семейства Бобовые (Leguminosae), а особенно – с представителями важных для сельского хозяйства культур – клевера, люцерны, бобов, гороха (Bothe et al., 2007).
В настоящее время указанная группа симбиотических диазотрофов включает виды родов Rhizobium (Frank, 1889), Bradirhizobium, Sinorhisobium (Chen et al., 1988)/Ensifer (Casida, 1982), Azorhizobium, Agrobacterium (Conn, 1942), Phyllobacterium (Fisher, 1994; The Rhizobiazeae…, 1998; Masson-Boivin et al., 2009). В 2006 г описан первый представитель нового рода Shinella в семействе Rhizobiaceae - Shinella granuli (Dong-Shan et al., 2006), а в 2013 г опубликовано сообщение о выделении из ризосферной почвы нута нового представителя азотфиксаторов Cicerobacter lividus, который наиболее схож с представителями рода Ensifer, однако, выделен в новый род Cicerobacter (Kathiravan et al., 2013). Кроме того, для устранения неопределенности в систематическом положении и номенклатуре некоторых представителей семейства Rhizobiazeae на основании результатов проведенного мультилокусного анализа последовательностей определенной группы генов «домашнего хозяйства» (housekeeping genes) было предложено выделить внутри семейства два новых рода Neorhizobium (Mousavi et al., 2014) и Pararhizobium (Mousavi et al., 2015).
К настоящему времени известен только один случай формирования ризобиями азотфиксирующего симбиоза с представителем не из семейства Бобовые, таковым является род Parasponia семейства Вязовые (Ulmaceae) (The Rhizobiaceae…, 1998; Bothe et al., 2007).
Взаимодействие между двумя партнерами, осуществляющими симбиотическую фиксацию, инициируется молекулярным взаимовлиянием, которое активно изучается на протяжении многих лет. Флавоноиды или изофлавоноиды, секретируемые растением-хозяином, индуцируют у соответствующих бактерий экспрессию множества генов, участвующих в образовании корневых утолщений – «клубеньков». Такие гены носят название nod-генов. Продукты nod-генов – ферменты, участвующие в биосинтезе видоспецифичных липополисахаридов, называемых Nod-16 факторами. Эти сигнальные молекулы, выделяемые бактериальными клетками, вызывают скручивание корневых волосков растения и деление клеток меристематической ткани, приводя к образованию корневых утолщений – «клубеньков». Инфекционный процесс прогрессируя, проявляется в корневом кортексе. Бактериальные клетки внедряются в клетки растения-хозяина, где продолжают делиться и дифференцируются физиологически и морфологически, в так называемые бактероиды, которые превращают атмосферный азот в аммиак (Fisher, 1994; Prell et al., 2006; Masson-Boivin et al., 2009).
Гены микроорганизмов, необходимые для участия в процессе симбиотической азотфиксации, включают гены, которые вовлечены в синтез Nod-факторов, развитие «клубеньков», синтез азотфиксирующего аппарата и метаболизм бактероидов. Известно также множество генов растений, экспрессия которых специфично индуцируется в тканях корня при взаимодействии с микроорганизмами-симбионтами. Таким образом, формирование эффективно функционирующих корневых «клубеньков» требует согласованной экспрессии как бактериальных, так и растительных генов. На ранних стадиях симбиоза это обеспечивается обменом высокоспецифичными химическими сигналами. На поздних стадиях экспрессия определенных бактериальных генов и морфогенез корневых утолщений координируется посредством изменения концентрации кислорода, по отношению к которому инфицирующие бактерии очень чувствительны. Комбинированный эффект специализированных растительных клеток, действующих как ограничитель диффузии кислорода, и поставщик леггемоглобина, который обратимо связывает кислород, приводит к значительному снижению концентрации кислорода внутри инфицированных тканей. В ответ на этот физиологический «переключатель» у микроорганизмов инициируется экспрессия генов азотфиксации (Fisher, 1994). В настоящее время известны фотосинтезирующие представители группы Bradyrhizobium, которые используют независимую от Nod факторов стратегию вступления в симбиоз с некоторыми видами Aeschynomene (Giraud et al., 2004; Masson-Boivin et al., 2009).
В случае симбиоза с водными растениями бактериальные клетки прокладывают свой путь в ткани растения через межклеточные пространства боковых корней растения (Masson-Boivin et al., 2009).
Среди ризобий встречаются диазотрофы, которые обладают дополнительной метаболической активностью, например, метилотрофия (Methylobacterium nodulans) и фотосинтез (BTAi 1, представитель из группы Bradyrhizobium, относительно таксономического положения которого, однако, до сих пор нет единого мнения) (Giraud et al., 2004; Masson-Boivin et al., 2009).
Симбиоз между Azorhizobium сaulinodans и его партнером – тропическим бобовым растением Sesbania rostrata уникален тем, что клубеньки возникают не только на корнях, но и на стеблях. Более того A. сaulinodans способен расти в чистой культуре с молекулярным азотом в качестве единственного источника азота при относительно высоких концентрациях кислорода. Таким образом, Azorhizobium caulinodans объединяет в себе признаки свободноживущего и симбиотического диазотрофа (Fisher, 1994; Masson-Boivin et al., 2009).
Определение числа КОЕ на безазотистой среде
В настоящее время процесс денитрификации наиболее хорошо изучен на примере двух микроорганизмов – Paracoccus denitrificans и Pseudomonas stutzeri. На первом этапе денитрификации нитрат восстанавливается до нитрита диссимиляционной нитратредуктазой, с этой реакцией сопряжено образование АТФ (Myrold, 2002; Bothe et al., 2007). У P. denitrificans сайт восстановления NO3- расположен на мембране и обращен в сторону цитоплазмы, поэтому требуется транспортная система для NO3-. Считается, что транспортным белком в данном случае выступает narK. Этот белок образует димеры, и один из двух белков в димере катализирует симпорт NO3-совместно с Н+. Вслед за импортом NO3- и инициацией анаэробного дыхания следует экспорт NO2- в периплазматическое пространство. Соответственно, фермент второго этапа денитрификации у P. denitrificans располагается в периплазме. Нитрит восстанавливается до оксида азота нитритредуктазой. Существует два типа нитритредуктазы. Гем-содержащая нитритредуктаза более распространена и встречается приблизительно у 2/3 всех денитрифицирующих бактерий, остальные содержат медь-содержащую нитритредуктазу. На данный момент не ясно, существуют ли значительные отличия в кинетике и регуляции этих двух типов фермента, которые могли бы предоставлять конкурентные преимущества в определенных условиях, не обнаружено даже видоспецифичного их распределения. Известно, однако, что оба эти типа нитритредуктазы присутствуют в клетках представителей родов Pseudomonas и Azospirillum, хотя, в общем, для грамотрицательных бактерий не свойственно присутствие обоих типов фермента в клетке одновременно (Myrold, 2002; Bothe et al., 2007).
Большинство грамотрицательных бактерий, в отличие от P. denitrificans, содержит нитратредуктазу в периплазматическом пространстве и поэтому им не нужно транспортировать NO3- в цитоплазму. Вторым важным отличием является то, что нитритредуктаза P. denitrificans – гем-содержащий ферментный комплекс, в то время, как у большинства грамотрицательных бактерий – это медь-содержащий фермент (Bothe et al., 2007).
Оксид азота NO – свободно диффундирующий посредник, который восстанавливается до N2O NO-редуктазой, встроенным в мембрану белком. Это шаг, при котором формируются N – N связи. Окончательное восстановление N2O до N2 катализирует редуктаза закиси азота – медь содержащий периплазматичесский фермент, работа которого ингибируется ацетиленом. Благодаря этому метод ацетиленового блокирования используется для оценки интенсивности процесса денитрификации в сочетании с применением газовой хроматографии (Yoshinari et al., 1977; Myrold, 2002; Bothe et al., 2007). У грамположительных бактерий периплазматическое пространство отсутствует, а ферментные белки, встроенные в цитоплазматическую мембрану, имеют структуры, обращенные наружу клетки. Имеются отличия и в потоке электронов (Bothe et al., 2007).
Ферменты денитрификации обнаружены и у архей, например, у экстремального галлофила и гипертермофила Pyrobaculum aerophilum. Медьсодержащая диссимиляционная нитритредуктаза выделена из клеток денитрифицирующего галофильного архея Haloarcula marismortui. Кроме того, гены, которые, предположительно, кодируют NO3- – транспортеры, нитрат- и нитритредуктазы, обнаружены в сиквенсах геномов представителей Crenarchaeota и Euryarchaeota (Bothe et al., 2007).
В настоящее время известно, что участие грибов, включая некоторые дрожжи, в процессе денитрификации связано с функционированием диссимиляторных редуктаз – нитрат-, нитрит- и NO-редуктазы, однако N2O-редуктаза не была описана ни для одного из их представителей (Кураков, 2003; Bothe et al., 2007). Нитрат- и нитритредуктазы грибов и дрожжей являются аналогами нитратредуктазы и медь-содержащей нитритредуктазы соответственно бактерий, в то время как NO-редуктаза грибов представляет собой уникальный фермент (Bothe et al., 2007).
Микроорганизмы, осуществляющие процесс денитрификации Относительно большая фракция почвенных микроорганизмов может принимать участие в процессе денитрификации. Типичные денитрификаторы составляют до 20 % микробной биомассы от общей культивируемой почвенной популяции. Денитрификаторы представлены различными группами микроорганизмов. В этом отношении денитрификация более схожа с аммонификацией, нежели с нитрификацией. Данный процесс осуществляют различные органотрофные, хемолитотрофные, фототрофные, азотфиксирующие, термофильные, галофильные бактерии и археи, а так же грибы (Myrold, 2002; Schmidt et al., 2002; Paul, 2007). Наиболее распространенными представителями денитрифицирующих бактерий являются виды родов Alcaligenes и Pseudomonas, Bacillus, Agrobacterium, Flavobacterium (Myrold, 2002; Schmidt et al., 2002; Paul, 2007). Хотя способность к денитрификации может увеличить выживаемость и возможности роста в анаэробных условиях, денитрификация среди ризобий – редкое явление, ее удалось наблюдать только у Bradirhizobium japonicum и Azorhizobium caulinodans. Это истинные денитрификаторы. При культивировании в микроаэробных условиях с нитратом, который выступает и как конечный акцептор электронов, и как источник азота, эти микроорганизмы последовательно восстанавливают нитрат с выделением молекулярного азота на последнем этапе (Bothe et al, 2007).
Динамика численности аммонификаторов
Динамика численности аммонификаторов изучалась одновременно для двух группировок бактерий внутри одной физиологической группы: аммонификаторов, образующих H2S, и аммонификаторов, не обладающих данной физиолого-биохимической активностью. Дифференцированный подход к изучению динамики численности аммонификаторов связан с попыткой выявить не только функциональные, но и структурные особенности физиологических групп микроорганизмов почв залежи и поля. Поскольку известным фактом является наличие селекционного процесса в отношении отдельных групп микроорганизмов в почвах сельскохозяйственных систем под монокультурой картофеля (Liu et al, 2014), нами была поставлена задача выявления аналогичных процессов в исследуемой интенсивно обрабатываемой почве картофельного поля, и возможной оценки масштабности указанных процессов, с использованием в качестве контроля залежной почвы. Основываясь на данных о том, что некоторые конститутивные белки в тканях клубней картофеля являются ингибиторами протеиназ (Ибрагимов и др., 2003), среди которых встречаются серосодержащие белки в виде димеров, связанных дисульфидными связями (Валуева и др., 2003), мы использовали группу аммонификаторов, способных метаболизировать серосодержащие аминокислоты, в качестве показателя наличия или отсутствия селекционного процесса микроорганизмов по трофическому признаку, а также изменения структурных показателей физиологической группы аммонификаторов в почве поля, при сравнении с почвой залежи.
При изучении динамики численности аммонификаторов наблюдали значительное преобладание аммонифицирующих бактерий, в образцах поля, возделываемого по интенсивной системе земледелия, над численностью в залежи (критерий Уилкоксона-Манна-Уитни, Z=5,4691, а = 0,001, для аммонификаторов, не образующих H2S). В целом, численность КОЕ в почве поля более чем на порядок превышала численность КОЕ в залежи.
В начале эксперимента количество аммонификаторов, не образующих H2S в почве поля составляло 1,35 107 КОЕ/г почвы, затем произошло пятикратное увеличение численности КОЕ (с 1-х до 8-х суток), и было достигнуто значение 6,17 107 КОЕ/г почвы. В дальнейшем наблюдали сначала незначительное снижение количества КОЕ до 3,93 107 КОЕ/г почвы (на 19-е сутки), а потом - резкий спад до 5,21 106 КОЕ/г почвы (рис. 8).
В залежи тенденция по увеличению численности КОЕ более выражена, а разница между исходным значением (1,41 106 КОЕ/г почвы) и наибольшими значениями, достигнутыми на 8-й (1,61 107 КОЕ/г почвы) и 11-й дни (1,49 107 КОЕ/г почвы) составляла один порядок. После 11-го дня произошел резкий спад числа КОЕ в почве залежи (рис. 9).
Количество КОЕ аммонификаторов, не образующих Н2S, более чем на порядок превосходило в точках максимума число КОЕ аммонификаторов, образующих Н2S и окрашивающих среду в черный цвет как в почве поля (1,63 106 КОЕ/г почвы), так и залежи
На начальных этапах сукцессии, инициированной увлажнением образцов почв, темноокрашенные колонии аммонификаторов, образующих Н2S, не обнаруживались в почве залежи, однако присутствовали в малых количествах в интенсивно обрабатываемой почве поля. В дальнейшем динамики КОЕ практически не различались, за исключением двукратного численного преобладания КОЕ аммонификаторов в почве поля (критерий Уилкоксона-Манна-Уитни, Z=3,6617, а = 0,001). В залежи темноокрашенные колонии не превышали 106 КОЕ/г почвы, и, вероятно, данная группа аммонификаторов не является физиологически значимой для этой почвы (рис. 10).
Наблюдаемые особенности в динамике численности аммонификаторов почв залежи и интенсивно обрабатываемого поля могут служить отражением структурных характеристик данной физиологической группы бактерий и свидетельствуют о различных траекториях развития микробных сообществ исследуемых почвенных систем. Различия в численности и динамике роста КОЕ аммонификаторов, образующих Н2S, подтверждают наличие различий в структуре физиологических групп аммонификаторов почв залежи и поля, а также указывают на существование особенностей, связанных с реализацией трофических функциональных возможностей аммонификаторов этих почв.
В процессе ежедневного определения количества N-NH4+ в исследуемых почвах с момента внесения в них пептона, отмечали постоянное увеличение концентрации N-NH4+, как в почве залежи, так и поля. Более интенсивное накопление N-NH4+ характерно для образцов почвы поля, однако эта разница статистически не достоверна. На 11 сутки эксперимента измеряемые концентрации N-NH4+ в почве залежи и поля были равны (рис. 11).
В данном случае функциональные изменения не видны на фоне значительного изменения численности микроорганизмов. Однако повышение содержания аммонийного азота в почве поля согласуется с динамикой численности аммонифицирующих бактерий на начальном этапе сукцессии (с 1 по 8-е сутки). В почве залежи четко выраженной зависимости содержания N-NH/ от численности аммонификаторов не отслеживается. Отсутствие достоверных различий потенциальной активности аммонификации в почвах залежи и интенсивно обрабатываемого поля маскирует различия путей развития микробных сообществ двух почвенных систем, поскольку за сходством величин активности данного процесса (как интегрального показателя) скрыты существенные и достоверные различия структурной организиции физиологической группы аммонификаторов, выявляемые и оцениваемые по динамическим показателям их численности, а также по особенностями реализации трофических возможностей.
Изучение динамики актуальной активности денитрификации выявило достоверное преобладание интенсивности образования N20 почвой залежи (критерий Уилкоксона-Манна-Уитни, Z=4,5638, а = 0,001). На начальном этапе эксперимента (1 день) (рис. 12) в активности денитрификации почв залежи и поля различий не выявлено. В дальнейшем отмечено периодическое возрастание (до 9-го дня эксперимента) актуальной активности денитрификации в почве залежи до значения, превышающего в 3 раза исходное, и последующий спад (до 17-го дня), который вновь сменился возрастанием активности. Интенсивность денитрификации в почве залежи имела не только более высокие значения, чем в обрабатываемой почве поля, но и определялась на протяжении всего периода наблюдений. В интенсивно возделываемой почве поля отмечалась нерегулярность актуальной активности денитрификации, для которой характерно чередование периодов практически полного прекращения выделения N2О с кратковременными всплесками активности, при которых исходное значение, зафиксированное в первый день эксперимента, достигнуто не было (рис. 12).
Активность гидролиза флуоресцеин диацетата в образцах почв залежи и поля
Чем ближе значение RS к 1, тем более устойчива система, и наоборот, чем больше значение RS приближается к -1, тем система более лабильна. Почва залежи характеризуется схожей с почвой поля резистентностью только в отношении добавок невысоких доз азота (20 С/N и 0,00001 г N, 10 С/N и 0,00002 г N, С = N и 0,0002 г N/г почвы).
Исследование дыхательной активности свежеотобранных образцов почв в эксперименте № 3 производилось после прохождения первичной сукцессии. Для почвы залежи при этом также была характерна более высокая активность дыхания, чем для почвы поля, и более выраженные колебания скорости эмиссии СО2 (рис. 26, 27). На фоне увлажненной почвы (рис. 26) как в залежи, так и в поле наблюдалось незначительное повышение активности дыхания после внесения глюкозы (рис. 27 а), и добавок сочетающих азот и углерод в своем составе (рис. 27 в, г). Добавление азота в отсутствие источника углерода не стимулировало дыхательную активность, а, наоборот, подавляло ее (рис. 27 б), что наблюдалось и в эксперименте № 2.
Динамика скорости выделения СО2 после прохождения первичной сукцессии и увлажнения в почвах залежи и поля; – залежь, – поле.
Добавки сочетающие в своем составе углерод, азот и фосфор, вызывали наиболее активную эмиссию СО2 как в почве залежи, так и поля (рис. 27 д, е).
Все экспериментальные образцы почвы залежи характеризуются более значительным размахом колебаний дыхательной активности. Для образцов почвы поля свойствен меньший по интенсивности дыхательный ответ на внесение добавок, и более равномерная эмиссия СО2. Вместе с тем, изучение динамики активности дыхания в переувлажненной почве с добавками глюкозы и нитрата калия (эксперимент № 4), выявило большую интенсивность дыхания в почве поля (рис. 28), в то время как при оптимальной влажности данная почва отличалась более низкой скоростью эмиссии СО2, чем почва залежи (эксперименты 1-3).
Вместе с тем, в процессе мультиреспираторного тестирования почв, наблюдали активное потребление глюкозы микробными сообществами залежи и поля. Видимое, на первый взгляд, противоречие разрешается данными микроскопического исследования почв, которое выявило преобладание микромицетов в почве залежи. Ограничение поступления кислорода в почвенную систему одновременно с ее обогащением легкодоступным источником углерода, способствовало не только окислению части субстрата (в основном в верхних слоях культуральной суспензии), но и сбраживанию его (в нижних слоях) в процессе мультиреспираторного тестирования. Таким образом, общая эмиссия углекислого газа в почвенной системе складывалась из двух потоков, имеющих различное происхождение. В процессе измерения активности дыхания в переувлажненной почве сбраживанию глюкозы (2 мг/г почвы), внесенной в почву, препятствовала добавка нитрата калия, нитрат же служил и альтернативным акцептором электронов, в почвенной системе с дефицитом доступного кислорода. Таким образом, часть микробного сообщества переключается с процесса аэробного дыхания, на процесс денитрификации, а деятельность бродильщиков ингибируется, за счет чего снижается их вклад в поток СО2 из почвы. Поскольку почва залежи богата грибной микробиотой, в отличие от почвы поля, то и снижение ее активности влияет на такие интегральные показатели биологической активности почв, как дыхание.
В Эксперименте № 5 изучена динамика дыхательной активности стерильных образцов почв залежи и поля, обработанных суспензиями, приготовленными из нативной почвы и растворами углерод- и азотсодержащих добавок в условиях переувлажнения. Выявлено, что в случае внесения в стерильный образец почвы залежи суспензии, приготовленной из нативного образца почвы поля (рис. 29 б, обозначено ПВЗ), наблюдается более высокая активность дыхания, чем при внесении в такой же образец суспензии из нативного образца почвы залежи (рис. 29 а, обозначено ЗВЗ).
То же справедливо для почвы поля: при внесении в стерильный образец почвы поля суспензии, приготовленной из нативного образца почвы залежи (рис 29 а, обозначено ЗВП), наблюдается более высокая активность дыхания, чем при внесении в такой же образец суспензии из нативного образца почвы поля (рис. 29 б, обозначено ПВП).
Фотоколориметрическая оценка активности гидролиза ФДА была использована для определения живой микробной биомассы, а именно как интегральный показатель ее активности в почвенных образцах залежи и поля. Значения стартовой ферментной активности в образцах свежей почвы и в почвах после инициирования сукцессионного процесса представлены в талице 4.
После внесения глюкозы в почвенные образцы в почве залежи отмечена большая активность микробной биомассы в сравнении с почвой поля.
Поскольку активность гидролиза ФДА является неспецифическим интегральным показателем состояния микробного сообщества, он был использован, так же как и результаты измерения активности азотфиксации, денитрификации и дыхания, для оценки резистентности почвенных систем залежи и поля по различным имеющимся на сегодняшний день методикам (таблица 5).
Результаты оценки резистентности почвенных систем залежи и поля по активности неспецифических функциональных возможностей микробных сообществ указывают на принципиальное их различие по данным показателям. В литературных источниках, описывающих различные микробные системы, широко распространено мнение о том, что их благополучное функционирование связано с наличием значительной резистентности. Однако анализ такого показателя требует понимания динамики структурных и функциональных характеристик почвенного микробного сообщества. Без учета указанных особенностей сравнению могут подвергнуться совершенно разные по своей структурно-функциональной организации системы, находящиеся в альтернативных, но устойчивых состояниях, показатели которых могут быть численно как различны, так и очень близки. В таком случае, выявлению различий у сравниваемых систем способствует привлечение все большего числа показателей.
Оценку широты спектра функциональных возможностей микробных сообществ исследуемых почвенных экосистем проводили с использованием метода мультиреспираторного тестирования (МРТ).
В результате оценки эффективности потребления различных субстратов почвенными микроорганизмами методом МРТ получены качественно и количественно различные значения активности потребления таких субстратов как сахара (глюкоза, галактоза), многоатомные спирты (маннитол), аминокислоты (лизин) и соли органических кислот (ацетат натрия). На рисунке 26 представлены качественные результаты теста в виде изменения цвета индикатора в результате диффузии СО2 в гель.