Структурно-функциональные особенности инсерционного элемента IS100 чумного микроба Трухачев, Алексей Леонидович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Чума является тяжелым инфекциошшм
заболеванием человека, для которого характерна высокая
контагиозность и летальность. Существование множественных
природных очагов и эпидемическая опасность этой инфекции
обусловливают неослабевающий интерес исследователей к изучению
возбудителя чумы (Yersinia pestis). В настоящее время
охарактеризованы многие факторы вирулентности Y. pestis, выявлены
их генетические детерминанты, обнаружена важная роль

инсерционных последовательностей (IS-элементов) в их инактивации, приводящей к снижению или потере возбудителем чумы патогенных свойств.

IS-элементы представляют собой небольшие по размеру фрагменты
ДНК, способные к самостоятельной репликации и перемещению
(транспозиции) в геноме несущих их клеток. Большинство известных в
настоящее время бактериальных IS-последовательностей имеет широ
кий круг хозяев в микробном мире, однако у целого ряда патогенных
бактерий обнаружены специфические элементы, участвующие в регу
ляции экспрессии факторов патогенности. Одним из таких мобильных
элементов является IS100, обнаруженный у Y. pestis^ а также у
близкородственных бактерий возбудителя псевдотуберкулеза

(Y.pseudotuberculosis). Известно, что у возбудителя чумы транспозиции IS100 является причиной высокочастотных инсерционных и делецион-ных мутаций по признакам, коррелирующим с вирулентностью бактерий: зависимость роста при 37С от наличия в среде ионов кальция (Portnoy& Falkow, 1981; Filippov et al., 1995, 1998) и способность сорбировать экзогенные пигменты при 26С (Fetherston et al., 1992,1994; Buchrieser et al., 1998). Однако механизмы активации транспозиции этого элемента в настоящее время неизвестны. Для раскрытия этих механизмов необходимы - данные о структурной и функциональной организации IS100, которые могут дать в руки исследователям ключ к пониманию процессов, лежащих в основе регуляции вирулентности одного из наиболее патогенных видов бактерий - возбудителя чумы.

Анализ последовательности нуклеотндов IS 100 (Podladchikova et al., 1994; Filippov et al., 1995; Hare et al., 1996) выявил одну его структурную особенность: IS100 не имеет промотора для экспрессии содержащихся в нем двух открытых рамок считывания (огП и orf2). Такая молекулярная организация предполагает, что транспозиция элемент¹ должна зависеть от наличия внешнего промотора, расположенного в последовательностях ДНК, окружающих этот элемент. Экспериментальные данные, подтверждающие это предположение, в

литературе отсутствовали. Вместе с тем решение этого вопроса является необходимым для понимания того, какие регуляторные факторы заставляют IS100 перемещаться в геноме Y.pestis и инактивировать важные для вирулентности гены. В геноме Y.pestis IS!00 имеет большое число копий (более 20) в хромосоме и по крайней мере по одной копии - в каждой из трех плазмид чумного микроба. Хотя теоретически любая из копий может служить донором при транспозиции IS100, имеющиеся в литературе данные (см. обзоры Хесин, 1985; Galas & Chandler, 1989) свидетельствуют о том, что мелкие плазмиды являются предпочтительными донорами при транспозиции lS-элементов. Эти данные позволяли предположить, что наиболее вероятным донором IS 100 при его транспозиции в геноме Y.pestis может быть 9,5 kb-плазмида pYP, кодирующая бакгериоцин пестицин и активатор плазминогена. Поэтому в качестве объекта экспериментального исследования роли внешних промоторов в функционировании IS 100 мы выбрали именно плазмиду pYP.

В ходе исследования была обнаружена еще одна особенность IS100: помимо генов, необходимых для транспозиции, он несет информацию, экспрессия которой влияет на поверхностные свойства хозяйских клеток. Подобное явление не было описано ни для одного IS-элемента. Более того, общепризнанным считается мнение, что IS-элементы, в отличие от транспозонов, содержат только генетическую информацию, необходимую для их перемещения в геноме, и влияют на хозяйскую клетку исключительно за счет последствий транспозиции, приводящих к реорганизации генома. Поэтому доказательство того факта, что IS 100 действительно содержит гены, экспрессия которых влияет на фенотип хозяйской клетки, представляло интерес не только в плане выяснения роли IS 100 в физиологии возбудителя чумы, но и в плане расширения представлений о биологических функциях мобильных генетических элементов.

Цель работы. Целью исследования явилось выявление структурно-функциональных особенностей инсерционного элемента IS 100 и на его основе разработка теста для внутриродовой дифференциации иер-сииий.

Задачи исследования. Для достижения цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние внешних промоторов на экспрессию генов IS 100 с помощью метода молекулярного клонирования в клетках кишечной палочки.

1. Осуществить поиск регуляторных элементов транскрипции, способных обеспечивать экспрессию генов IS100, на участке плазмиды pYP, предшествующем двум большим открытым рамкам считывания этого элемента.«

2. Оценить возможность использования праймеров, комплементарных IS100, для детекции возбудителей чумы и псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Научная новизна. В работе впервые проведено экспериментальное исследование структурно-функциональных особенностей IS 100: выявлено влияние внешних промоторов на транспозиционную активность и способность IS100 вызывать делеции ДНК, в том числе и своих собственных последовательностей; при секвенировании участка ДНК плазмиды pYP, предшествующего IS 100, выявлены последовательности, позволяющие предположить наличие оригинального механизма регуляции экспрессии генов IS 100 в этой плазмиде. При изучении IS 100 получено экспериментальное свидетельство в пользу гипотезы о том, что функции IS-элементов не ограничены их транспозиционной активностью,' а могут' быть связаны и с наличием в них генетической информации, влияющей на фенотипические свойства хозяйских клеток. Практическая значимость. В результате проведенных исследований получен набор рекомбинантных плазмид, содержащих гены IS 100 под контролем регулируемых промоторов. Рекомбинантные плазмиды могут быть использованы для изучения роли IS 100 в физиологии возбудителей чумы и псевдотуберкулеза. В работе предложен тест для детекции и идентификации Y.pestis и Y.pseudotuberculosis І серовари-анта с помощью ПЦР с праймерамн, комплементарными IS100. Тест может быть применен для совершенствования схемы диагностики возбудителей чумы и псевдотуберкулеза и их дифференциации от других иерсиний. Основные положения, выносимые на зашиту:

1. С помощью метода молекулярного клонирования получен набор рекомбинантных плазмид, различающихся наличием и расположением внешнего промотора по отношению к IS100.

2. Для проявления транспозиционной активности IS 100 необходим внешний промотор, направляющий транскрипцию двух крупных открытых рамок считывания элемента.

3. Транспозиционная активность IS 100 г. .оставе рекомбинантных плазмид приводит к образованию делеций как в векторной ДНК, так и в ДНК самого элемента.

4. В плазмиде pYP Y.pestis перед IS100 имеются последовательности, потенциально способные регулировать транскрипцию генов IS100.

5. IS100 содержит генетическую информацию, экспрессия которой определяет изменение фенотипических свойств рекомбинантных штаммов Е.соН.

6. Олигонуклеотиды, полненные на основе последовательностей IS 100, можно использовать для детекции Y.pestis и Y.pseudotuberculosis І серотипа методом ПЦР.

Апробация работы. Материалы работы неоднократно докладывались на научных конференциях и конкурсах молодых ученых и специалистов Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института, представлялись на Конгрессе микробиологических обществ в г. Иерусалиме, Израиль (1996г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, список которых приводится в конце автореферата. Структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописи, состоит из введения, заключения, выводов и трех глав, включающих: обзор литературы, описание материалов, методов и результатов собственных исследований. Текст иллюстрирован 6 таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает 189 печатных работ.