Введение к работе
В последние десятилетия работами ведущих микробиологических лаботаторий мира со всей очевидностью продемонстриро-ванно значительное распространение стрептококков группы В (СГВ) среди людей. Около четвертой части населения планеты инфицировано данным микробом независимо от возрастных категорий (Baker С, Barretti F. 1983, Easmon С. 1983, Jelinkova J. 1977). Наиболее остро стоит вопрос о роли стрептококков группы В в патологии беременности и новорожденных. СГВ относятся к наиболее распространеным возбудителям данной патологии. Особую опастность, в качестве источника инфекции, представляют матери-носители. Заражение ребенка происходит либо внутриутробно, либо при прохождении через родовые пути. У детей заболевание протекает в форме менингита и сепсиса и в 20-50% случаев заканчивается летально (Klein J. 1984, Concia Е. et.al 1984, Ferried P. 1985).
Борьба с данной патологией, по существу, является борьбой за здоровое материнство и детство. Следовательно, изучение биологии и патогенетических свойств стрептококков группы В актуально не только с научной, но экономической и социальной точек зрения.
Хорошо известно, что вирулентность стрептококков группы В коррелирует с их способностью продуцировать типоспецифиче-скую полисахаридную капсулу (Durham D. 1981). Однако, наряду с полисахаридами СГВ продуцируют на поверхность большую группу веществ белкового происхождения, таких как нук-леазы, протеазы, CAMP фактор, IgA рецепторы и т.п., роль которых в формировании вирулентности изучена недостаточно.
В последнее время среди потенциальных факторов вирулентности стрептококков групп А и В внимание исследователей привлекает белковый агент, вызывающий подавление хемотаксиса полиморфоядерных лейкоцитов (ПМЯл) и макрофагов в очаг инфекции - С5а пептидаза (SCP). С5а пептидаза обладает способностью специфически расщеплять С5а фракцию комплемента, являющуюся главным хемоаттрактантом для макрофагов и поли-морфноядерных лейкоцитов. Это дает стрептококкам возможность избежать фагоцитоза, и, в конечном итоге, способствует их выживанию в макроорганизме, в первую очередь в воротах инфекции.
Несмотря на очевидную медицинскую актуальность патологий, вызываемых стрептококками группы В, генетика этих микроорганизмов практически неисследована. Имеются лишь фрагментарные данные о нескольких генах, кодирующих факторы вирулентности СГВ. В настоящее время в современной научной литературе практически отсутствует информация о гене, кодирующем синтез С5а пептидазы стрептококков группы В. Известно лишь об ограниченной гомологии между пептидазными генами стрептококков групп А и В. Выше сказанным определяется актуальность данного исследования.
Целью настоящего исследования является анализ структуры и функции гена G5a пептидазы стрептококков группы В, для чего планировалось выполнить следующие задачи:
-
Проанализировать широту распространения гена С5а пептидазы среди штаммов стрептококков группы В разных серотипов.
-
Выяснить нуклеотидную последовательность гена С5а пептидазы стрептококков группы В.
-
Осуществить анализ нуклеотидной последовательности scpB гена.
-
Проклонировать ген в гетерологичной системе E.coli с использованием экспрессионного плазмидного вектора.
-
Выделить рекомбинантный белок С5а пептидазы.
-
Проанализировать свойства С5а пептидазы стрептококков группы В биохимический и иммунологическими методами.
-
Сконструировать изогенные мутанты стрептококков группы В с нарушенной экспрессией гена SCP.
Научная новизна работы состоит в том, что:
-
Впервые показано, что ген С5а пептидазы представлен в хромосомной ДНК всех проанлизированных штаммов стрептококков группы В.
-
Впервые определена нуклеотидная последовательность гена С5а пептидазы стрептококков группы В.
-
Впервые проклонирован полноразмерный ген С5а пептидазы СГВ в гетерологичной системе E.coli с использованием экспрессионного вектора pGEX.
-
Впервые получен и проанализирован рекомбинантный белок С5а пептидазы стрептококков группы В.
-
Впервые сконструированы инсерционные мутанты стрептококков группы В с нарушенной экспрессией гена С5а пептида-
зы, что позволит в дальнейшем использовать их для получения приоритетных данных о вкладе SCPB (С5а пептидазы стрептококков группы В) в формирование вирулентного фенотипа СГВ.
-
Впервые показано, что С5а пептидазы стрептококков групп А и В обладают антигенным сходством.
-
Впервые было показано, что гены SCP у стрептококков групп А и В высоко гомологичны.
Теоретическая ценность.
Данная работа носит теоретический характер. Показано, что ген С5а пептидазы высоко консервативен по структуре в пределах вида, что может указывать на важность С5а пептидазы для выживания и стрептококков группы В в организме-хозяине и колонизации инфицированных тканей. В ходе работы было выявлено, что ген С5а пептидазы стрептококков группы В имеет 98% гомологии с соответствующим геном стрептококков группы А се-ротипа М12 и 95% - М49, что может указывать на эволюционную связь стрептококков группы А и В или на возможность генетического обмена между стрептококками разных видов.
Практическая ценность.
Проведенные исследования могут быть использованы для создания штамма-продуцента С5а пептидазы, имеющего биотехнологическое значение. С5а пептидаза как белок, имеющийся у всех штаммов стрептококков группы В, может быть основой для коплексных полисахаридно-белковых вакцин. Не исключено, что SCP может использоваться для лечения некоторых аутоимунных заболеваний и в хирургической практике, но этот вопрос нуждается в доработке.
Положения, выносимые на защиту:
-
Ген С5а пептидазы стрептококков группы В присутствует во всех клинических штаммах стрептококков этой группы, что указывает на биологическую значимость белка, кодируемого этим геном.
-
Ген С5а пептидазы стрептококков группы В гомологичен гену С5а пептидазы стрептококков группы А, что указывает на общность происхождения этих генов.
-
С5а пептидаза стрептококков группы В по своим биохимическим и иммунологическим характеристикам аналогична ранее изученным С5а пептидазам стрептококков группы А.
Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:
-
Высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования (полимеразная цепная реакция, секвенирование, ДНК-ДНК гибридизация, иммуноблотинг и т.д), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные.
-
Применением наиболее современных способов компьютерного анализа данных секвенирования ДНК с привлечением таких банков данных как GENBANK, ЕМВО и т.д.
Апробация работы.
Материалы диссертации опубликованы в 4 научных трудах, доложены на четырех симпозиумах и конференциях: «Новые направления биотехнологии» в 1992 г., «XII международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям им. Ленсфильд» в 1993 г., «Биотехнология Санкт-Петербург-94» 1994 г., «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» 1995 г. Материалы работы докладывались на заседании отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1994, 1995 гг.) и на конференции отдела микробиологии Университета Миннесоты (США) (1995 г.).
Объем и структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного текста, включающего: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, 6 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы. Работа проиллюстрирована б таблицами и 26 рисунками. Указатель литературы содержит 156 источников.