Содержание к диссертации
Введение
Введение 4
1. Обзор литературы 8
1.1. Органическое вещество почвы и его состав 8
1.2. Минерализация органического вещества почвы микроорганизмами 17
2. Объекты и методы исследования 34
2.1. Методы выделения чистых культур анаэробов рода Clostridium из почвы 34
2.2. Методы изучения физиолого-биохимических особенностей выделенных культур анаэробов рода Clostridium, ... 37
2.3. Методика выделения препаратов гумусовых веществ. . . 40
2.4. Схема проведения эксперимента 41
2.5. Методы определения элементного и функционального состава 42
3. Результаты исследований 47
3.1. Выделение чистых культур анаэробов рода Clostridium их отбор и идентификация 47
3.2. Изучение физиолого-биохимических свойств чистых культур анаэробных бактерий рода Clostridium 57
3.2.1. Метаболизм соединений углерода 57
3.2.2. Отношение выделенных культур анаэробов к источникам азотного питания 64
3.3. Трансформация гумусовых соединений анаэробами рода Clostridium в зависимости от использования их в качестве источника углерода или азота 69
3.3.1. Характеристика полученных фракций гумусовых веществ 69
3.3.2. Сравнительное изучение устойчивости разных фракций гумуса к воздействию анаэробов рода Clostridium 74
3.3.3. Изменение функционального состава гумусовых веществ в результате микробиологической трансформации в зависимости от особенностей метаболизма анаэробов 87
3.3.4. Особенности разложения гумуса представителями разных физиологических подгрупп бактерий рода Clostridium. 98
Выводы 102
Литература. 105
Приложения 132
- Органическое вещество почвы и его состав
- Методы выделения чистых культур анаэробов рода Clostridium из почвы
- Выделение чистых культур анаэробов рода Clostridium их отбор и идентификация
Введение к работе
Актуальность темы. Директивами майского Пленума ЦК КПСС (1982), направленными на решение в нашей стране Продовольственной программы, предусмотрено дальнейшее повышение урожайности и качества сельскохозяйственной продукции на основе расширенного воспроизводства почвенного плодородия. В успешном выполнении этих задач важное место принадлежит гумусу почвы, являющемуся одним из наиболее важных почвенно-экологических факторов, оптимизирующих условия произрастания растений. Однако, как показывает практика сельскохозяйственного производства, широкое применение минеральных удобрений, интенсивных систем обработки почв, мелиорации и узкоспециализированных севооборотов сопровождается повышенной минерализацией свежего органического вещества и деградацией гумуса. При этом почвы утрачивают ряд агрономически ценных свойств: обесструктуриваются, снижают емкость поглощения, буферность, водоудерживающую способность, что приводит к заметному падению их плодородия.
Одной из наиболее важных причин, вызывающих в условиях современного земледелия деградацию гумуса, является высокая интенсивность микробиологических процессов его разложения. Вопросам микробиологической минерализации гумусовых соединений посвящен ряд исследований (Кононова М.М., 1976; Теппер Е.З., 1976; Александрова Л.Н., 1980; Latter P., Burges А.,I960; Bubovska А., Масог м., 1976 и др.). Однако в настоящее время остается слабо изученной специфика трансформации гумусовых веществ микроорганизмами в зависимости от различных условий их жизнедеятельности. - 5 -В то же время известно, что современный уровень антропогенного воздействия на почву сопровождается существенным изменением ее экологической обстановки. Это приводит к нарушению естественного равновесия в микробных ценозах почв, перестройке в их функциональной и таксономической структуре. В новых условиях многие микроорганизмы могут переходить на другой тип обмена веществ, изменяя способность к продуцированию ферментов, физиологически активных веществ, газообразных продуктов метаболизма и т.д. Существенно изменяется при этом интенсивность и направленность процессов минерализации органического вещества и, в частности, гумуса. В этих условиях многие ранее изученные закономерности микробиологической трансформации гумусовых веществ нуждаются в существенных уточнениях или новых экспериментальных разработках.
Участие анаэробной группировки почвенных микроорганизмов в трансформации гумуса до сих пор не было изучено. В то же время, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что деятельность анаэробов, в частности представителей рода Clostridium, существенным образом сказывается на свойствах почвы, в особенности - на ее плодородии (Новогрудский Д.М., 1956; Мишустин Е.Н., Емцев В.Т., 1974; Skinner Р.А., 1975). Для выяснения их роли в разложении гумуса требуется проведение дополнительных обстоятельных экспериментов.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлось выявление способности к разложению гумусовых соединений широко распространенными в почвах анаэробными бактериями рода Clostridium. В соответствии с поставленной целью в работе предусматривалось решить следующие задачи: - выделить из различных типов почв чистые культуры анаэро- - б - бов рода Clostridium разных физиологических подгрупп; изучить физиолого-биохимические свойства исследуемых бактерий и идентифицировать наиболее активные из них по способности трансформировать гумусовые вещества; выяснить специфику трансформации гумуса в зависимости от его фракционного состава и различных условий культивирования анаэробных бактерий рода Clostridiumj - изучить метаболизм анаэробов при их инкубировании на гу мусовых соединениях в различных условиях среды: когда фракции гумуса являются единственным источником углерода или азота.
Научная новизна. Из различных типов почв Советского Союза впервые были выделены разнообразные представители рода Clostridium, активно трансформирующие гумусовые вещества. У изученных анаэробов различных физиологических подгрупп выявлены различия в интенсивности и механизме трансформации гумусовых веществ. Установлены закономерности в изменении интенсивности и направленности процессов минерализации гумуса анаэробами рода Clostridium в зависимости от источников углеродного или азотного питания. Экспериментально показана специфика и активность процессов разложения гумуса в зависимости от его фракционного состава и типа метаболизма изученных штаммов анаэробных бактерий рода Clostridium.
Практическая ценность. Полученные экспериментальные данные рекомендуется использовать для разработки научно-обоснованных мероприятий по направленному регулированию процесса разложения ) гумусовых веществ, обеспечивающих бездефицитный баланс гумуса в почвах. Разработанные нами методологические подходы, позволяющие выявлять направленность и интенсивность процессов транс- - 7 -формации гумусовых веществ в зависимости от условий культивирования анаэробов, могут быть использованы в лабораториях почвенной микробиологии научно-исследовательских институтов и вузов.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Республиканском семинаре "Методические вопросы экологии почвенных микроорганизмов" (Киев, 19-23 сентября 1983 г.), на научной конференции в ТСХА (Москва, 6-9 декабря 1983г.), на Всесоюзном семинаре "Закономерности роста микроорганизмов" (Пущино, 6-8 декабря 1983 г.), на Международном симпозиуме "Гумус и растение УШ" (Прага, 29 августа - 3 сентября 1983 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы три статьи.
Ра'бота выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии имени К.А.Тимирязева и в лаборатории трансформации азота микроорганизмами Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (г. Ленинград).
Автор выражает глубокую благодарность научномуруководите-лю - лауреату Государственной премии СССР, доктору биологических наук, профессору В.Т.Емцеву и заведующему лабораторией трансформации азота микроорганизмами ВНЙИСХМ, кандидату биологических наук Н.А.Туеву, старшему научному сотруднику лаборатории экологии и физиологии почвенных микроорганизмов ВНИИСХМ, кандидату биологических наук И.И.Черняевой за ценные консультации и помощь в работе.
Органическое вещество почвы и его состав
В настоящее время общепризнано, что органическое вещество почвы - его количественное содержание и качественное состояние -являются одним из важнейших элементов плодородия. Гумус составляет основу органического вещества почвы, и его содержание колеблется в пределах от 40 в южных сероземах до 300 т/га в тучных черноземах (Ковда В.А., 1973).
Образовавшийся в результате сложных биохимических и чисто химических процессов гумус сравнительно устойчив к микробиологическому разложению. Методом меченых атомов установлено, что отдельные его фракции имеют возраст от 25 до 35 тысяч лет (Герасимов И.П., 1970; Герасимов И.П., Чичагова О.А., 1971; Martin J.P. Haider К., 1971). В почве количество гумуса остается сравнитель-но постоянным, что свидетельствует о динамическом равновесии процессов его синтеза и распада. Если же накопление отстает от распада, то содержание гумуса в почве медленно падает.
Ежегодно минерализуется сравнительно незначительная часть почвенного органического вещества. Так, в большинстве почв в среднем разлагается и обновляется от 2 до 4 т/га гумуса. В зональном аспекте эти показатели могут достигать более значительных величин: от 1% или менее в почве очень холодного климата до 25$ - в тропических. В регионах с умеренным климатом годовой обмен почвенного гумуса составляет в среднем 3% (Кононова М.М., 1976; Александрова Л.Н., 1980). Скорость разложения его биологическими и химическими агентами контролируется, главным образом, уровнем влажности, аэрации, температуры, значением рН, природой органического материала, минералогическим составом почв и др.
Современные представления о почвенном гумусе формировались в течение длительного времени. Уже в работах классиков естествознания 19 века К.Шпренгеля, Я.Берцелиуса и Г.Мульдера было установлено, что гумус почвы является природным образованием и главнейшие составные части его представлены сложными органическими соединениями специфической природы. Особо пристальное внимание к гумусу привлекло учение В.В.Докучаева о почве. Большое значение имели исследования П.А.Костычева, установившего высокую роль микроорганизмов в синтезе гумусовых веществ. Изучением химической природы гумуса занимались В.Р.Вильяме, С.Оден, А.А.Шмук, 0. Щрайнер и Е.Шорн. Оригинальную концепцию о природе гумуса создал американский микробиолог С.Ваксман, считавший, что главная масса гумуса представлена лигно-протеиновым комплексом.
В настоящее время советскими и зарубежными учеными детально изучены состав и свойства гумуса, разрабатывается теория гумификации органических веществ в почве, исследуется роль гумуса в почвообразовании и плодородии.
На основании исследований природы и свойств гумусовых соединений они подразделяются на две основные группы: гуминовые и фульвокислоты. Гуминовые кислоты характеризуются слабой растворимостью в воде и обладают способностью накапливаться на месте своего образования. Фульвокислоты составляют группу воднораство-римых гумусовых соединений и относительно легко мигрируют по почвенному профилю.
Методы выделения чистых культур анаэробов рода Clostridium из почвы
Объектами исследования служили чистые культуры"анаэробных бактерий рода Clostridium, выделенные из разных типов почв.
Как известно, в зависимости от используемого субстрата анаэробы рода Clostridium делятся на ряд физиологических подгрупп: сахаролитические, протеолитические, пуринолитические и др. (Ми-шустин Е.Н., Емцев В.Т., 1974). Нами были вьщелены представители разных физиологических подгрупп данных микроорганизмов.
Изолирование анаэробов рода Clostridium осуществляли с помощью накопительных культур. Для этого комочек почвы около I г) помещали в фарфоровую ступку, смачивали стерильной водой, растирали до пастообразного состояния (Звягинцев Д.Г., 1969) и переносили в пробирку с соответствующей элективной средой.
Выделение чистых культур анаэробов из накопительных проводили в трубках Вейона (Бычковская А.Я., 1965; Емцев В.Т., Дзад-замия Т.Д., 1969) и в анаэростатах, в которых создавали вакуум с остаточным давлением в 10 мм рт.ст.
Представителей сахаролитической подгруппы анаэробов рода Clostridium выделяли на модифицированной среде Виноградского-Емцева (%): К2НР04 - 0,1; MgS04.7H20 - 0,05; NaCl,MnS04.5H20, FeS0 .7H О - следы; глюкоза - 2,0; пептон - 0,5; микроэлементы по Федорову - 1,0 мл/л; дрожжевой автолизат - 0,002; СаС03 -0,5 (предварительно простерилизованный мел добавляли отдельно в каждую пробирку и вновь стерилизовали со средой), РН среды -7,2-7,4.
Во все среды для выделения анаэробов в качестве SH -соединения, создающего условия для протекания восстановительных реакций, вводили цистеин (0,03$). К среде его добавляли непосредственно перед опытом, что позволяет снизить окислительно-восстановительный потенциал и сбалансировать его на оптимальном уровне. Как индикатор на изменение рН среды добавлялся нейтраль-рот (0,004$). Для уменьшения конвекционных потоков в жидкие среды вводили 0,05-0,1$ агара.
Инокулированные пробирки инкубировали при температуре 37С. После активного забраживания (интенсивное газообразование и изменение цвета) проводили пересев культур анаэробов в чашки Петри на картофельно-морковный агар Емцева (%): КрНРОд - 0,05; MgSOy, . 7Н20 - 0,05; Had, .бН О, FeS04 .7Н20 - среды; глюкоза - 0,5; пептон - 0,05; дрожжевой автолизат - 0,02; СаС03 - 5,0; цистеин - 0,03; картофельно-морковный отвар - 50,0; агар-агар - 2,0. Ph. среды = 7,2-7,4.
Протеолитические анаэробы рода Clostridium выделяли на селективной среде для протеолитических анаэробов (ССПА), предложенной Горовой А.К. (1979). Состав данной среды следующий ($): гидролизат казеина - 50,0; пептон - 3,0; дрожжевой автолизат -4,0; хлорид натрия - 0,3; ацетат натрия - 0,1; смесь микроэлементов по Форду (Ford J.Е., 1962) - 10,0 мл/л, цистеин - 0,03, Ph. среды - 7,2; Селективность среды обусловливалась внесением антибиотиков: неомицина и полимикеина М в концентрации 50 мкг/мл и 50 ед/мл соответственно. При изготовлении плотных сред к указанному составу добавляли 2,0$ агара.
Выделение чистых культур анаэробов рода Clostridium их отбор и идентификация
Из окультуренных и целинных образцов разных типов почв -дерново-подзолистой, чернозема, серозема и краснозема - было получено 75 накопительных культур анаэробных бактерий рода Clostridium. Из них выделено 50 штаммов чистых культур анаэробов, относящихся к различным физиологическим подгруппам.
Изучение морфологии выделенных чистых культур анаэробов показало, что большинство из них представляют собой подвижные с перитрихальными жгутиками прямые, иногда слегка искривленные палочки. Расположены поодиночке, иногда попарно. По мере старения в процессе цикла развития клетки исследуемых бактерий теряют подвижность, накапливают гранулезу - запасное вещество типа крахмала - и переходят к спорообразованию. Трехсуточные культуры почти всех штаммов состоят из клостридиальных клеток и незначительного числа цилиндрических палочек, встречаются и оформившиеся споры. Как известно, способность образовывать покоящиеся клетки, эндоспоры, обладающие устойчивостью к нагреванию, ионизирующей радиации и ультрафиолетовому свету - общий признак для всех представителей рода Clostridium (Мишустин Е.Н., Емцев В.Т., 1974).
Все выделенные чистые культуры микроорганизмов - облигатные анаэробы, токсическое действие кислорода связано с высоким содержанием у них флавиновых ферментов и отсутствием цитохромов и каталазы. Грамположительные. Не восстанавливают сульфаты в сульфиты.
С целью отбора наиболее активных культур анаэробов, в сравнительном аспекте было изучено их воздействие на гумусовые вещества при использовании последних в качестве единственного источника углерода. Для инокуляции использованы свежевыделенные анаэробные бактерии рода Clostridium, относящиеся к различным физиологическим подгруппам. В этом предварительном опыте, гумусовые вещества были получены из дерново-подзолистой почвы при помощи 0,1н раствора NaOH (I кг почвы заливали 5 л щелочи) и разделены на две фракции - гуминовые и фульвокислоты. Препараты гумусовых веществ были переосаждены и тщательно очищены диализом.
Схема опытов предусматривала варианты с использованием гумусовых соединений в качестве единственного источника углерода и азота, единственного источника углерода и варианта с добавлением глюкозы в качестве ко-субстрата (0,5%). Присутствие в среде гумусовых веществ не приводило к угнетению роста анаэробных бактерий. Для культур анаэробов Clostridium на средах с гуматами характерен быстрый рост, накопление большого количества биомассы, отсутствие ярко выраженной стационарной фазы. Наиболее интенсивное наращивание биомассы отмечалось в вариантах с фульвокислота-ми.
Благоприятное воздействие соединений гумуса на развитие анаэробов Clostridium, по-видимому, можно связать с тем, что входящие в их состав ароматические группировки типа фенолов обладают восстанавливающими антиокислительными свойствами и способностью ингибировать свободно радикальные процессы (Кононова М.М., 1965; Senezi N., Schnitzer М#, 1977).
