Введение к работе
Лісгуальность проблемы. Совершенствование специфической профилактики чумы является одной из актуальных задач иммунологии. Решеїше этой проблемы требует комплексного подхода, который включает в себя исследование механизмов формирования протішочумного иммунитета. Фундаментальными исследованиями ряда ученых (Пустовалов В.Л. с соавт.,1984; Васильева Г.И. с соавт.,1990-1998; Ледванов М.Ю. с со-авт., 1990-1997; Наумов А.В. с соавт.,1992) было доказано, что течение вакцинного и инфекционного процессов при чуме в значительной степени зависит от исхода взаимодействия клеток макрофагального звена с возбудителем инфекции.
К настоящему времени изучено влияние чумного мікроба и его антигенов на ряд функциональных, метаболических и морфологических изменений клеток системы моно-нуклеарных фагоцитов (СМФ). Современные представления о роли клеток СМФ основываются на их гетерогенности по функциональной активности, экспрессии поверхностных структур, регуляторним и эффекторным свойствам. Мононуклеарные фагоциты выполняют множество функций в большинстве из которых участвует клеточная поверхность и большое количество мембран-связанных плазматических молекул клеток (рецепторы к Fe-части иммуноглобулина, к компонентам комплемента, к терминалу сахарных остатков и т.д.). Необычайная сложность проблемы гетерогенности фагоцитарных клеток требует разработки новых нетрадиционных подходов к ее анализу. Одним из методов тестирования функционального состояния клеток СМФ является определение их электрофоретической подвижности (ЭФП), обусловленной величиной электрического заряда клеток. Электрический заряд, структура поверхностной мембраны и функциональные свойства клетки находятся в тесной взаимосвязи. Метод проточного распределительного клеточного электрофореза в свободном потоке дает возможность изучить характер изменений ЭФП клеток под действием на организм или непосредственно на мононуклеарные фагоциты различных антигенов и вакцин. В работах ряда исследователей (Ермакова Г.В.,1982; Корсуков В.Н.,1984; Ледванов М.Ю., 1984; Тихомирова Л.А.,1985; Тихомирова Е.И.,1990) показана возможность использования данного метода в качестве важного иммунологического критерия, характеризующего изменения ЭФП лимфоцитов в процессе иммуногенеза к чуме. Тем не менее, нами не было найдено работ, касающихся динамики изменений ЭФП фагоцитіфующік клеток при формировании иммунитета к чуме. Неизвестна популяционная и функциональная гетерогенность фагоцитов, различающихся по признаку электрофоретической подвижности. Известно, что популяции клеток СМФ различаются по экспрессии ключевых ферментов окислительного и гликолитического пути метаболизма (Хаитов P.M., 1995). Однако сравнительной оценки биохимических показателей электрокинетически гетерогенных популяций фагоцитов при взаимодействии с различными штаммами чумного микроба до настоящего времени не проводилось.
Цель работы: изучить влияние чумного микроба и его антигенов на функционально-метаболическую активность электрокинетически гетерогенных популяций фаго-
цитирующих клеток, определить возможность использоващм показателей электрофоретической подвижности фагоцитов для оценки иммунобиологических свойств чумного микроба и его ангигенов, а также иммуномонгаоринга противочумного вакцинного процесса.
Задачи исследования
-
Изучить влияние иммунизации мышей (беспородных и инбредных) вакцинным штаммом Y.pestis EV на изменение электрофоретической подвижности перитонеальных макрофагов.
-
Определить характер и количественные критерии изменения электрофоретической подвижности перитонеальных макрофагов при взаимодействии in vitro с клетками Y.pestis EV.
-
Изучить влияние иммунизации мышей и морских свинок основным соматическим и капсульным антигенами Y.pestis на изменение электрофоретической подвижности перитонеальных макрофагов.
-
Установить изменения электрофоретической подвижности моноцитов крови людей при взаимодействии in vitro с основным соматическим и капсульным антигенами Y.pestis.
-
Провести сравнительный анализ изменений ключевых ферментов пентозофосфатного пути обмена углеводов (глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы), цикла Кребса (сукцинатдегидрогеназы) и гликолиза (лактатдегидрогеназы) в электрокинетически гетерогенных фракциях фагоцитов в динамике взаимодействия с основным соматическим и капсульным антигенами Y.pestis.
-
Изучить функциональную активность электрокинетически гетерогенных популяций макрофагов при взаимодействии in vitro с клетками Y.pestis EV.
-
Определить возможность использования показателей электрофоретической подвижности фагоцитов для оценки иммунобиологических свойств чумного микроба и его антигенов, а также для иммуномониторинга противочумного вакцинного процесса.
Научная новизна. Впервые с использованием свободного распределительного клеточного электрофореза в потоке показано, что иммунизация белых мышей вакцинным штаммом Y.pestis EV сопровождается снижением электрофоретической подвижности основного пула перитонеальных макрофагов и появлением электрофоретически гетерогенных популяций. Обнаружено, что изменения электрокинетических свойств макрофагов в процессе иммуногенеза к чуме зависят от генотипа животных. Инбредная линия мышей CC57W реагирует меньшим, по сравнению с беспородными, снижением электрофоретической подвижности (ЭФП) макрофагов. Выявлены характерные для линии CC57W особенности формирования электрофоретически гетерогенных популяций перитонеальных макрофагов.
Впервые установлено, что иммунизация белых мышей основным соматическим и капсульным антигенами чумного микроба вызывает снижение ЭФП основной массы макрофагов, формирующих в большинстве сроков исследования две электрофоретически различающиеся популяции. Капсульный антиген обладает более выраженной, по сравнению с основным соматическим, способностью снижать ЭФП фагоцитов. Макрофаги не-
иммунизированных морских світок формируют пять электрофоретически гетерогенных популяций. Иммунизация морских свинок капсульным антигеном сопровождается резким снижением ЭФП макрофагов и преобладанием трех электрофоретически различающихся популяций клеток.
Новыми являются данные, показавшие, что адгезия макрофагов к стеклу, сопровождающаяся активацией клеток, приводит к фазному изменению ЭФП популяций фагоцитов - снижению ЭФП, сменяющемуся повышением их электрокинетического потенциала. Взаимодействие in vitro макрофагов яашотных и моноцитов крови людей с клетками и антигенами Y.pestis EV сопровождается характерными изменениями конфигурации кривой распределения макрофагов по электрофоретической подвижности.
Впервые исследован в электрокинетически гетерогенных популяциях фагоцитов характер изменений активности ключевых ферментов углеводного обмена. Показано, что взаігмодействие in vitro антигенов чумного микроба с моноцитами крови людей сопровождается снижением их электрофоретической подвижности и увеличением вігутриклеточной активности ключевых ферментов пентозофосфатного пути обмена углеводов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и гиколитического пути - лактатдегидрогеназы. Под влиянием капсульного антигена активность сукцинатдегидрогеназы снижается. Внутри общего пула выделенных моноцитов максимальные ферментативные активности регистрируются в субпопуляциях, характеризующихся более высокой электрофоретической подвижностью.
Комплексный анализ функциональной (фагоцитарного индекса и фагоцитарной активности) и метаболической активности различных типов фагоцитов позволил выявить наличие стереотипной реакции мембран в процессе активации клеток, выражающейся в снижении их злектрокинетического потенциала.
На модели взаимодействия (in vivo и in vitro) фагоцитирующих клеток с чумным микробом и его антигенами подтверждена необходимость пересмотра представлений и подходов к оценке роли этих клеток в иммунопатогенезе чумы с учетом их популяцион-ной гетерогенности.
Практическая значимость работы. Определены количественные критерии изменений электрофоретической подвижности макрофагов, нейтрофильных лейкоцитов и моноцитов при контакте in vivo и in vitro с чумным микробом и его антигенами. Расширены границы области практического применения проточного клеточного распределительного электрофореза для изучения функциональной активности отдельных популящш фагощггирующих клеток. Показана эффективность использования тестирования электрофоретической подвижности фагоцитов для характеристики иммунобиологических свойств антигенов чумного микроба и иммуномониторинга противочумного вакцинного процесса. Метод определения электрофоретической подвижности фагоцитирующих клеток (тестирование формирования электрокинетически гетерогенных популяций фагоцитов) рекомендуется для использования на этапах испытания новых или усовершенствованных противочумных вакцинных препаратов, а также при составлении рациональных
схем иммушізации и при экспериментальной разработке патогенетически обоснованных способов иммуиокоррекции.
Внедрение. По материалам эксперимигсальных исследовгний составлены методические рекомендации: "Оценка попуяяционного состава клеток системы мононуклеарных фагоцитов методом разделительного клеточного электрофореза", которые были обсуждены и одобрены Ученым Советом РНИПЧИ "Микроб" (протокол №15 от 19 ноября, 1996г), утверждены директором 19 ноября, 1996г. Метод применяется в научных исследованиях на кафедре гистологии (СГМУ), НИИ кардиологии при СМУ, 5-ой детской объединенной инфекционной больницы г.Саратова, о чем имеются соответствующие акты о внедреіши. Материалы диссертационного исследоваши используются при чтении лекций на курсах спецішшзащш врачей по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей-бактериологов санитарно-эпидемиологических учреждений России (при институте "Микроб").
Апробация работы. Материалы диссертации представлены:
-на межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы, Алматы, 1994;
-на научной конференции, посвященной. 60-летию Иркутского ПЧИ, Иркутск, 1994;
-на итоговой научной конференции в РНИПЧИ "Микроб", Саратов, 1994;
-на международной конференции по тгмунореабилитащги, Дагомыс, 1994;
-на международной конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1996;
-на научной конференции "Эколого-эгшдемиологаческий надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии", Астрахань, 1996;
-на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997;
-на съезде аккушеров-гинеколов, Самара, 1997;
-на Российской научной конференции "Человек и здоровье", С.-Петербург, 1997.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной научной конференции лаборатории иммунологии РосНИПЧИ "Микроб", 1998г..
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста и содержит: введение, пять глав, заключение, выводы и библиографический указатель, который включает 162 отечественных и 95 иностранных источников. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 4 таблицами.