Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 как продуцент дельта-эндотоксина 11
1.2. Области применения Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 18
1.3. Лейкоциты периферической крови 21
1.3.1. Бактерицидные системы нейтрофилов 23
1.3.2. Лимфоциты 26
1.3.3. Моноциты 28
1.3.4. Нейтрофилъныелейкоциты 29
1.3.5. Эозинофилъные лейкоциты 31
1.3.6. Лейкоцитарная формула 32
1.4. Роль перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты при интоксикациях 34
1.5. Аланинаминотрасфераза и аспартатаминотрансфераза как показатель повреждения тканей организма 39
1.6. Токсичность дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 для теплокровных животных 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 45
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Выделение дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 56
3.2. Влияние дельта-эндотоксина на кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы нейтрофилов in vitro ...58
3.3. Действие in vivo дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на лимфоциты крови лабораторных мышей 69
3.4. Действие in vivo дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на субпопуляционный состав нейтрофилов 71
3.5. Влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vivo на кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы нейтрофилов крови лабораторных мышей 81
3.6. Влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность трансаминаз, лактатдегидрогеназы в сыворотке крови лабораторных мышей 86
3.7. Влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на показатели системы ПОЛ-антиоксидант в сыворотке крови мышей 89
Заключение 95
Выводы 97
Список использованных источников литературы 98
- Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 как продуцент дельта-эндотоксина
- Роль перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты при интоксикациях
- Влияние дельта-эндотоксина на кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы нейтрофилов in vitro
- Действие in vivo дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на субпопуляционный состав нейтрофилов
Введение к работе
Актуальность темы. Изучение метаболитов микроорганизмов является актуальным направлением в прикладной микробиологии. Особый интерес представляют исследования токсинов бактерий, особенностей их патогенетического действия на организм человека и животных и возможности практического использования в производстве медико-биологических препаратов (Монастырский, 2003; Новожилов, 2003). Энтомопатогенные препараты на основе спорово-кристаллических комплексов Bacillus thuringiensis широко используются для защиты сельскохозяйственных растений (Харвуд, 1992). В настоящее время до 90-95% мирового рынка биоинсектицидов занимают препараты на основе Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52. Дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 проявляет активность в отношении насекомых благодаря способности связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматических мембранах клеток кишечного эпителия, а затем проникать в них, формируя каналы-поры (Hodgman & Ellar, 1990; Smith & Ellar, 1994). Также этот дельта-эндотоксин проявляет активность в отношении ряда микроорганизмов, в том числе и фитопатогенных (Егоров, Юдина, Баранов, 1990; Юдина, Милько, Егоров, 1996). Уникальная избирательность взаимодействия дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 с мембранами клеток насекомых дает возможность использовать его для защиты агроценозов и лесных массивов от листогрызущих насекомых-вредителей (Иванова, 2005).
В России в настоящее время используются разнообразные препараты на основе В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 лепидоцид-50, дипел, битоксибациллин (для защиты деревьев, кустарников, овощей и лекарственных трав против бабочек), новодор, поражающий колорадского жука на посадках картофеля, томатов, баклажанов (Иванова, 2004). Разработаны так же новые препараты на основе очищенного от спор и
других балластных веществ и предварительно активированного эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 (Каменек 1998; 2005).
В этой связи особую актуальность приобретает вопрос токсичности этих препаратов для разных видов животных.
Существуют данные о безвредности дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 для млекопитающих, основанные на изучении его прямой токсичности (Хеймпел, 1976; Киль и др., 2002). Однако в литературных источниках отсутствуют биохимические исследования крови под действием дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на лабораторных животных.
Известно, что в организме насекомого дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 разобщает процессы окислительного фосфорилирования и дыхания (Heimpel, 1977; Faust, 1984; Aronson et al., 1986; Gill et al., 1992; Himeno et al., 1985; Каменек, 1998). Попадая в организм животного, дельта-эндотоксин может всасываться в кишечнике и взаимодействовать с элементами крови. При длительном воздействии токсических веществ в концентрациях, не вызывающих внешне обнаруживаемого эффекта, могут выявляться скрытые изменения ряда биохимических показателей системы крови, которая является чувствительным индикатором, отражающим состояние организма в целом.
Для оценки действия дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на организм теплокровных животных необходимо исследовать изменение биохимических процессов, в частности активности ферментов аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), активности миелопероксидазы и лизосомально-катионных белков нейтрофилов, что может служить показателем развития и интенсивности воспалительных процессов (Голиков 1986; Релева, 2007).
Таким образом, актуальной на настоящий момент является оценка действия дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на состояние
7 организма животного, что дает возможность охарактеризовать безопасность применения препаратов на его основе.
Цель настоящего исследования — изучить влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на клетки крови лабораторных мышей в условиях in vivo и in vitro.
Задачи исследования:
Изучить влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vitro на активность кислородзависимых и кислороднезависимых бактерицидных систем нейтрофилов лабораторных животных.
Изучить влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vitro на содержание и жизнеспособность эритроцитов периферической крови мышей.
Установить влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на количественный состав форменных элементов крови (лейкоцитов, эозинофилов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов) и значение лейкоцитарного индекса интоксикации лабораторных мышей.
Оценить действие дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность ферментов в сыворотке крови лабораторных мышей в условиях in vivo.
Изучить влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность процессов перекисного окисления липидов и ферментативного звена антиоксидантной защиты (каталазы) в крови лабораторных мышей in vivo.
Научная новизна. Впервые проведена оценка воздействия различных доз дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на механизмы киллинга в нейтрофилах лабораторных мышей, процентное содержание форменных элементов крови, жизнеспособность эритроцитов, активность ферментов в сыворотке крови, соотношение антиоксидантной системы.
Впервые установлена способность дельта-эндотоксина
В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в очень высоких дозах (1000; 500; 250 мг на кг массы животного) in vivo угнетать активность ферментов лизосом (миелопероксидазы, лизосомальных катионных белков), характеризующих кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные процессы в нейтрофилах; в дозе 50 мг на кг массы животного - стимулировать активность миелопероксидазы, лизосомально-катионных белков, а также увеличивать количество моноцитов и лимфоцитов. В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозе 25 мг/кг вызывал активацию механизма киллинга периферической крови животных in vivo.
Впервые показано отсутствие влияния сравнительно низких доз дельта-эндотоксина на активность ферментов ЛДГ, АсАТ, АлАТ и антиоксидантную систему сыворотки крови экспериментальных животных.
Практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в понимание механизма патогенетического действия дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на организм животного. Результаты работы позволяют дать рекомендации по обеспечению безопасности при производстве биоинсектицидов, содержащих дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, биохимии, проведении лабораторно-практических занятий и написании курсовых и дипломных работ в Ульяновском государственном университете.
Основные положения, выносимые на защиту:
Дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 не влияет в условиях in vitro на активность миелопероксидазы, катионных белков, фагоцитарной активности нейтрофилов и на содержание жизнеспособных эритроцитов.
Дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vivo в очень высоких дозах 1000; 500; 250 мг/кг массы животного вызывает угнетение
9 активности миелопероксидазы и катионных белков лизосом до 81% и 75% соответственно.
Дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозах 25-100 мг/кг не влияет на содержание эозинофилов, моноцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, активность каталазы и уровень вторичного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида в крови лабораторных мышей.
Пероральное введение дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 дозе 100 мг/кг вызывает снижение в крови лабораторных животных числа лимфоцитов на 31%. Действие дельта-эндотоксина в дозах 25 и 50 мг/кг вызывает увеличение числа этих форменных элементов и не вызывает изменений показателей лейкоцитарного индекса интоксикации.
Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis subsp, kurstaki Z-52 после шестикратного перорального введения испытуемых доз до 100 мг/кг не влияет на активность ферментов ЛДГ, АсАТ и АлАТ в сыворотке крови лабораторных животных.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и охраны природы. Пути их решения» (Ульяновск, 2007); научном семинаре «Геоэкологические проблемы Среднего Поволжья» (Ульяновск, 2008); научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); межкафедральных семинарах экологического факультета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета (2007-2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей
10 объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 112 страницах, содержит 3 таблицы и 17 рисунков. Список использованных литературных источников включает 144 наименования, в том числе 44 зарубежных.
Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 как продуцент дельта-эндотоксина
Bacillus thuringiensis повсеместно распространённая почвенная бактерия, в больших количествах находящаяся в силосной пыли и оборудовании зернохранилищ, впервые была открыта в Японии в 1901 году, вызывающая болезнь личинок тутового шелкопряда, и названная Bacillus Sotto.
Впервые разновидность бактерии В. thuringiensis subsp. thuringiensis была выделена в чистую культуру немецким учёным Берлинером (Berliner, 1911; 1915) из заболевших гусениц мельничной огнёвки (Anagasta kuehnilla Zell). Этот изолят был назван в честь провинции Турингии, в которой он был открыт.
Уникальной чертой В. thuringiensis является формирование, помимо споры, параспорального кристаллического включения, содержащего дельта-эндотоксин по номенклатуре А. Хеймпела (1976).
Впоследствии было обнаружено более 1000 разновидностей В. thuringiensis. Каждая разновидность продуцирует кристаллический белок, или дельта-эндотоксин, обладающий инсектицидным действием, который закодирован единственным геном на плазмиде в бактерии (Борисова, 1994). Инсектицидная активность токсинов каждой разновидности В. thuringiensis различается. Несмотря на это, комплекс дельта-эндотоксинов В. thuringiensis поражает множество видов из отрядов Coleoptera, Lepidoptera и Diptera. Некоторые дельта-эндотоксины В. thuringiensis обладают токсичностью наравне с использующимися и широко распространёнными фосфорорганическими пестицидами. В отличие от последних, токсины В. thuringiensis очень специфичны только к некоторым вредным насекомым и поэтому безопасны для большинства полезных насекомых и других животных. Токсины В. thuringiensis являются веществами, неустойчивыми в окружающей среде и в живых организмах.
Некоторые штаммы В. thuringiensis, помимо эндотоксина, вырабатывают в культуральную среду ряд экзотоксинов: ос-экзотоксин (действует на ферменты насекомых), Р-экзотоксин, или термостабильный экзотоксин (оказывает токсическое и мутагенное влияние на насекомых и других животных), р2-экзотоксин (нарушает физиологические процессы у насекомых и растений), у-экзотоксин (Честухина и соавт., 1977, Fedhila et al., 2002).
Полагают, что основным фактором энтомопатогенности В. thuringiensis являются параспоральные кристаллические белки (дельта-эндотоксины), остальные метаболиты, а также споры бактерии, которые усиливают активность кристаллов (Каменёк, 1998).
Коммерческий инсектицид на основе дельта-эндотоксина В. thuringiensis первоначально появился во Франции в 1938 году (Каменек, 1998). Промышленность же начала интересоваться использованием возбудителей болезней насекомых в 1956 г., после опубликования Штейнхаусом статей по микробиологической борьбе с использованием «живых инсектицидов». Через много лет инсектицид на основе дельта-эндотоксина В. thuringiensis появился в форме аэрозоля, предназначенного для применения на посевах. Неустойчивая природа инсектицида делала необходимым многократное применение во время первоначального использования.
Инсектицидная активность спорулирующих культур В. thuringiensis ограничена определённым кругом хозяев. Так, В. thuringiensis subsp. thuringiensis и subsp. kurstaki эффективны против личинок Lepidoptera. В настоящее время препараты на основе В. thuringiensis данных подвидов применяются для борьбы со многими важными видами чешуекрылых вредителей сельскохозяйственных культур, леса и запасов. Классификация В. thuringiensis основана на биохимических и серологических критериях. За последние 30 лет были выведены многочисленные линии В. thuringiensis с теми же характеристиками (параспоральное тело и патогенность, в основном, для гусениц чешуекрылых). Долгое время многие из ранее изолированных линий рассматривались как разновидности Bacillus cereus, однако затем было предложено группировать все образующие параспоральные кристаллы линии под названием В. thuringiensis (Heimpel and Angus, 1959).
Серологические свойства изолятов В. thuringiensis, полученных из различных источников, позволяют утверждать, что почвы особенно богаты штаммами подвида kurstaki, а из пресноводных водоёмов и морской воды высевается преимущественно подвид israelensis (Степанова и соавт., 1996).
В последнее время предложено классифицировать бактерию также по типу синтезируемых кристаллов (Crickinore and al., 1998). Различные штаммы В. thuringiensis синтезируют идентифицированных на настоящий момент 133 кристаллических белка. Большинство из них кодируется генами, классифицируемыми как Cry и Cyt. Cyt-гены кодируют белки с низкой молекулярной массой (34, 40 кД), способны вызывать лизис клеток не только насекомых, но и теплокровных животных, не обладают выраженной специфичностью, проявляют гемолитическую активность. Гены класса Cry кодируют токсины с молекулярной массой до 240 кД, обладающие высокой специфичностью в отношении клеток организма-хозяина. В настоящее время насчитывается не менее 21 подкласса в классе Cry-генов. Используемый нами дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki кодируется генами Cry IA, и, соответственно белок, синтезируемый этим геном, относится к классу CrylA.
Структура и доменная организация дельта-эндотоксина Дельта-эндотоксин синтезируется В. thuringiensis в результате процесса образования белка спор. Белковый кристалл представляет собой тетрамолекулярную поверхностно-центрированную кубическую структуру с размером ребра 123 А. Белковые кристаллы имеют сферическую структуру с диаметром 85 А. С помощью метода сканирующей электронной микроскопии выявлено два основных морфологических типа этих структур: бипирамидальные и кубоидные кристаллы. Кроме них обычно встречаются промежуточные формы, т.н. «сдвоенные» кристаллы, а также аморфные тельца; часто мелкие включения, особенно аморфные, встраиваются в структуру кристаллов. Возможно, что форма кристалла зависит от состава питательной среды (Faust, 1984).
Методом рентгеноструктурного анализа третичная структура определена для двух энтомоцидных белков: дельта-эндотоксина СгуЗА (67кДа), продуцируемого ssp. Tenebrionis, и "истинного токсина", соответствующего протоксину CrylAa (65кДа, ssp. kurstaki) (Grochulski P., Masson L., 1995). Выравнивание первичной структуры других эндотоксинов и расчет вероятной вторичной структуры позволяют говорить, что все они имеют принципиально сходную укладку полипептидной цепи.
Роль перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты при интоксикациях
Перекисное окисление липидов представляет ряд цепных реакций свободнорадикального характера. Особенность цепной реакции заключается в осуществлении большого числа коротких элементарных реакций с участием чередующихся активных центров - свободных радикалов или атомов. В конце каждого элементарного цикла воссоздается такое же число свободных радикалов, которое было в начале цикла, что составляет условие развития цепи. Если в конце цикла образуется большее число радикалов, чем в начале, то происходит разветвление цепей, число элементарных циклов возрастает и скорость процесса быстро увеличивается. Если, наоборот, в конце цикла число радикалов становится меньше, чем в начале, то происходит обрыв цепей, и реакция замедляется или вовсе прекращается (Владимиров, Арчаков и соавт., 1972). В организме основным источником свободных радикалов являются одноэлектронные пфеносы в реакциях биологического окисления (Washburn, 1973). Радикалы возникают при окислении гемсодержащих белков в катализируемой ксантиноксидазой системе окисления ксантина в мочевую кислоту (Кожевников, 1985).
Выдвинутая в 50-е гг. XX века Б.Н. Тарусовым и Н.М. Эммануэлем идея о возможности свободнорадикального перекисного окисления липидов in vivo подтверждена многочисленными биохимическими экспериментами на животных и исследованиями на человеке (Каган и соавт., 1986). Так, в частности, установлено, что процессы перекисного окисления липидов исключительно важны для нормального функционирования клеточного аппарата, а при их нарушении развивается разнообразная патология (Брюховецкий и соавт., 1985; Козлов и соавт., 1985; Мансурова и соавт., 1985; Мурашко и соавт., 1984).
Биологическое значение процессов перекисного окисления липидов в организме неоднозначно. Прежде всего, следует указать, что этот процесс играет определенную роль в нормальных условиях. Так, показано, что в тканях интактных животных имеется определенный уровень липопереокисления (Козлов, 1975) и отмечается взаимосвязь его с различными физиологическими реакциями. Среди них - процесс синтеза ДНК, регуляция метаболизма и функций сердца, транспорт электронов и окислительное фосфорилирование в дыхательной цепи митохондрий и микросом, состояние возбуждения в коре головного мозга, проведение возбуждения по нервам и в мышцах, проявление действия витамина D, механизм акцепции света и др. (Шведова и соавт., 1975). Повышенное содержание продуктов ПОЛ в биомембране приводит к ослаблению ее барьерной функции и повышению проницаемости для органических веществ и разных ионов (Каган, 1981). Продукты липопероксидации оказывают повреждающее действие на белки (Владимиров, 1972), тиоловые соединения, ДНК, нуклеотидфосфаты (Roubal et al, 1967), что, в конечном счете, отрицательно влияет на жизнедеятельность клетки. В отношении мембран митохондрий влияние перекисей четко документируется изменением окислительного фосфорилирования, в отношении микросом - изменением процесса гидроксилирования. Одной из главных причин повышения проницаемости мембран под влиянием продуктов ПОЛ признается образование гидрофильных включений в гидрофобном слое мембраны. Не исключены и другие механизмы, такие как уменьшение заряда на поверхности раздела мембрана - раствор, изменение конформации мембранного липопротеинового комплекса и др. (Владимиров и соавт., 1972). Действие окисленных липидов на белки может проявиться в инактивации ферментных систем клетки и, тем самым, обусловить конечный цитотоксический эффект продуктов перекисного окисления. Ведущими факторами дезорганизации клеточного метаболизма являются разобщение окислительного фосфорилирования митохондрий, ионный дисбаланс клетки и активация лизосомальных ферментов (Владимиров и соавт., 1972).
В последнее время внимание исследователей, занимающихся проблемами компенсации функций при различных воздействиях на организм, привлечено к ПОЛ как к одному из универсальных механизмов повреждения клеточных структур (Эндакова и соавт., 1994). Экспериментально установлено, при увеличении ПОЛ лимитирует адаптивные возможности организма при действии холода (Казначеев и соавт., 1980), тепла (Шепелев, 1976), острой гипоксии, мышечной нагрузки (Меерсон, 1993).
Существенное разнообразие реакций перекисного окисления придает им свободнорадикальный цепной характер. Первая реакция при всяком цепном окислении - зарождение цепи в результате взаимодействия активных радикалов кислорода с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови (Колесова и соавт., 1984). Диеновые конъюгаты (молекулы с двумя сопряженными двойными связями), возникают на стадии образования свободных радикалов и являются первичными продуктами ПОЛ. Дальнейшее превращение образовавшихся продуктов требует второй радикальной атаки и приводит к образованию МДА (Каган и соавт., 1986; Колосова и соавт., 1988). Диальдегиды типа МДА являются бифункциональным продуктом ПОЛ, и в результате взаимодействия этих продуктов с низко- и высокомолекулярными внутриклеточными компонентами, содержащими свободные аминогруппы (фосфатидилсерин, пептиды и др.), образуются конечные продукты ПОЛ- «Шиффовы основания» (Колесова и соавт., 1984).
Антиоксидантная система и ее функционирование в организме Для предотвращения патологического влияния продуктов ПОЛ в организме существует система антиоксидантнои защиты, которая определяет способность организма тормозить свободнорадикальное окисление липидов. Она включает ферментные и неферментные биохимические компоненты (Зенков и соавт., 1999; Vladimirov, 1996; Голиков и соавт., 1986; Воскресенский и соавт., 1992; 1989; Ramasarma, 1982; Goldberg, 1982; Foldes etal, 1982).
Влияние дельта-эндотоксина на кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы нейтрофилов in vitro
Для выделения дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 необходимо было предварительно получить споровую культуру и провести разделение кристаллов и спор. Культивирование В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 осуществляли в чашках Петри на агаризованной питательной среде №14 следующего состава (в %): кукурузный экстракт -0,7, глюкоза - 1, пептон - 0,5, NaCl - 0,2, MgS04 - 0,01, Na2HP04 - 0,3, К2НРО4 - 0,3, агар-агар - 15-20; рН среды 7,2-7,5. Культуру высевали на полупроницаемую целлофановую пленку, помещенную на поверхности питательной среды. Инкубировали при температуре 27 С в течение Зх суток. Контроль морфологии колоний проводили по общепринятым методикам, учитывая форму, размер, характер края колоний, консистенцию и прозрачность.
Морфология клеток В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 была типичной для вида - в мазках, окрашенных по способу Грама, наблюдали крупные палочки с прямыми концами, расположенные цепочками. Процесс спорообразования контролировали путем окрашивания сделанных в интервале времени наблюдения мазков с окраской по Пешкову.
Численность клеток подсчитывали в камере Горяева или на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 400 и 500 нм (Штерншис, 1976).
При изучении действия дельта-эндотоксина на клетки необходимо отделить кристаллы от спор и других токсинов. Для этого был применен модифицированный метод (Каменек, 1980), основанный на комбинации флотации спор (Gingrich, 1968) и дальнейшего разделения спор и кристаллов в двухфазной системе: водный раствор Na2S04 - четыреххлористый углерод (Pendleton and Morrison, 1966). Суть его заключалась в следующем: Зх суточную культуру В. thuringiemis sitbsp. kurstaki Z-52 суспендировали в бидистиллированной воде из расчета (3,5-4)" 10 6 спор и кристаллов в 1 мл воды. Суспензию центрифугировали при 500g в течение 7 мин., при этом растворимые токсины переходили в надосадочную фазу, которая удалялась. Осадок ресуспендировали и центрифугировали в течение 7 мин при 500g для удаления кусочков питательной среды и других возможных примесей. Полученный супернатант очень сильно взбалтывали в отдельном сосуде с притертой пробкой в течение 10 секунд, затем через 1-2 мин отстаивания снимали лопаточкой образовавшуюся пену, содержащую споры. Эту процедуру повторяли до почти полного прекращения пенообразования, что позволяло удалить около 60 % спор. Далее к очищаемой суспензии прибавляли равный объем четыреххлористого углерода и 1%-ного сульфата натрия из расчета 7 мл на каждые 10 мл суспензии. Смесь интенсивно перемешивали на магнитной мешалке до образования устойчивой суспензии и оставляли расслаиваться. После расслаивания отбирали водную фазу, содержащую кристаллы. Процедуру повторяли дважды. Конечная суспензия содержала менее 1% спор. К этой полученной суспензии добавляли равный объем хлороформа, интенсивно перемешивали до образования устойчивой эмульсии и оставляли до полного расслаивания. Верхняя - мутная (водная) фаза содержала кристаллы и, как показало микроскопическое исследование, была свободна от спор. Концентрацию кристаллов в водной фазе определяли спектрофотометрически (Штерншис, 1976) в кварцевых кюветах толщиной в 1см при длине волны 500 нм. В кювету сравнения помещали дистиллированную воду. Выход кристаллов от исходного количества составлял около 20%. Выделенные в водной фазе кристаллы хранили в замороженном состоянии при температуре 10 С.
Преимущество описанной методики состоит в том, что она не требует дорогостоящих экстрагентов и оборудования, легко воспроизводится, позволяет получать препараты с высокой степенью очистки.
В исследованиях необходимо было использовать растворенные кристаллы, так как известно, что кристалл-протоксин становится токсином только при растворении либо в щелочи, либо в кишечном содержимом насекомого. Поэтому предварительно осуществляли щелочной гидролиз полученных кристаллов по методике Кукси (Coocsey, 1968), которая заключалась в следующем: 6 мг кристаллов растворяли в 3 мл 0, 04 н NaOH в течение 60 мин при 30 С. После этого растворившийся материал осаждали центрифугированием при 5000g в течение 20 мин. К надосадочной фазе по каплям добавляли при перемешивании уксусную кислоту до рН 4,4. Смесь оставляли на 30 мин при 0С для окончательного формирования осадка, который удаляли центрифугированием в течение 15 мин при 10000 g. Осадок несколько раз промывали водой и подвергали лиофильной сушке. Активированные кристаллы использовали в экспериментах в виде порошка.
Набор гранул нейтрофила и его метаболизм обеспечивают осуществление основных его функций, связанных с фагоцитозом и киллингом патогенных микроорганизмов. При проникновении в организм токсичных веществ, бактерий происходит активация нейтрофилов и фагоцитоз (Пигаревский В.Е., 1978). При этом концентрация компонентов миелопероксидазной системы сильно увеличивается (Пигаревский В.Е., 1978). Усиление окислительного метаболизма ведет к образованию кислородных радикалов, которые вместе с перекисью водорода, миелопероксидазой составляют эффекторное звено кислородзависимого аппарата цитотоксичности (Маянский А.Н. и соавт., 1984). К кислороднезависимым механизмам относят влияние кислого рН, дефенсинов, семейства BPI-молекул, семейства САР-37-белков, лактоферрина, лизоцима, различных катионных белков (Долгушин и соавт., 2001). В фаголизосоме рН снижен за счет кислотности продуктов, содержащихся в азурофильных гранулах, и работы ионных помп. В результате усиления гликолиза образуется значительное количество молочной кислоты, которая токсична для многих бактерий (Долгушин и соавт., 2001, Славинский, 2002). Низкомолекулярные катионные белки убивают микроорганизмы, разрушая их внешние мембраны. Спектр антимикробной активности катионных белков широк, они действуют против грамположительных, грамотрицательных бактерий, грибов и крупных вирусов. Все эти белки ингибируют рост бактерий, связываясь с кислыми группами на клеточной стенке, однако точные механизмы их действия неизвестны (Долгушин и соавт., 2001). Изменение содержания компонентов миелопероксидазной системы и катионных белков позволит нам выявить влияние дельта-эндотоксина на организм животного.
Действие in vivo дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на субпопуляционный состав нейтрофилов
Полученные данные свидетельствуют о том, что на 3 сутки после введения дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозах 25 и 50 мг/кг отмечался резкий подъем активности миелопероксидазы in vivo, что свидетельствует об активировании антимикробной системы мышей.
Дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозе 100 мг/кг на 7 сутки после перорального введения вызвал снижение активности фермента миелопероксидазы по сравнению с контролем на 46%. Угнетение миелопероксидазной активности нейтрофилов продолжалось на протяжении всего времени эксперимента и к 42 суткам достигло 85% относительно контроля. Это, возможно, связано с возрастанием дефицита кислорода в клетках крови и, как следствие, угнетением активности данного фермента (Логвиненко О.В., 2008).
Влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность ЛКБ нейтрофилов in vivo В ходе исследования не установлено изменения активности ЛКБ по сравнению с контролем при введении дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозе 25 мг/кг, а в дозе 50 мг/кг показатели выше контрольных в среднем на 26%. Происходило постепенное снижение активности ЛКБ в группе мышей с вводимой дозой дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 100 мг/кг через 7 суток, к 14 суткам разница с контрольными показателями составила 54%. К 42 суткам показатели активности ЛКБ снизились до 0,04±0,03, что отличалось от контроля на 85%. Так как активность ЛКБ в нейтрофилах отражает выраженность адаптационных процессов, то можно сделать вывод о том, что в дозе 100 мг/кг дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 вызывает снижение адаптационной способности организма животных. Влияние высоких доз дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность миелопероксидазы нейтрофилов in vivo Для установления влияния дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в высоких дозах (250, 500 и 1000 мг/кг) на активность миелопероксидазы, опытным животным в течение 54 суток дважды в неделю вводили дельта-эндотоксин. При введении мышам больших доз дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 (500 и 1000 мг/кг) же через сутки происходило снижение активности миелопероксидазы в нейтрофилах крови; на 14 сутки значения СЦК снизились на 50 и 70% по сравнению с контролем (до 0,22±0,02 и 0,18±0,03 у.е. соответственно); к 28 суткам это снижение составило 81% (рис.13.). Дельта-эндотоксин в дозе 250 мг/кг также вызывал снижение значения СЦК миелопероксидазы. Максимальное снижение было зафиксировано на 28 сутки - 0,19±0,3. К концу эксперимента, к 54 суткам разница с контролем составила 83%). Полученные результаты можно объяснить, по-видимому, неспецифической реакцией нейтрофилов на чужеродный белок. Влияние высоких доз дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 на активность ЛКБ нейтрофилов in vivo Для установления влияния дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в высоких дозах (250, 500 и 1000 мг/кг) на активность лизосомально-катионных белков, опытным животным в течение 54 суток дважды в неделю вводили дельта-эндотоксин. Контрольная группа животных дельта-эндотоксин не получала. В ходе исследования было установлено следующее: дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 через сутки после его перорального введения снижает активность лизосомально-катионных белков нейтрофилов, что выражалось в их угнетении при всех изученных дозах (рис. 14). Дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозе 500 мг/кг вызывал снижение активности ЛКБ до 0,25±0,07 (75 %), а в дозе 1000 мг/кг значение активности снизилось до 0,24±0,03 (на 74%) относительно контрольных значений. В меньшей дозе дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 250 мг/кг минимальное значение лизосомально-катионных белков отмечено через 14 суток - 0,30±0,04 (70%), что отличалось от контрольных значений к концу эксперимента, к 54 суткам на 47%.
Таким образом, в ходе исследований, можно сделать вывод о том, что дельта-эндотоксин В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 вызывал снижение активности катионных белков лизосом, максимальное снижение достигло 75% по сравнению с контрольным значением. Угнетающее действие дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 in vivo в высоких дозах (250, 500 и 1000 мг/кг) связано, вероятно, с неспецифической реакцией организма лабораторных мышей на чужеродный белок, способный проникать в кровоток.
