Введение к работе
Актуальность проблемы. К числу кардинальных проблем микробиологии относится вопрос регуляции роста и развития культур микроорганизмов. Решение этого вопроса неразрывно связано с изучением внутренних и внешних факторов, определяющих развитие как отдельных микробных особей, так и всей популяции в ц*лом. В связи с этим большое внимание уделается микробным метаболитам, выделяемым в окрукавщуи среду, играющим сигнальную роль в регуляции роста и развития микроорганизмов (Хохлов 19?S, І988; Зль-Регистан и др., І979).
Вместе с тем накоплен обиирныЛ материал о влиянии на рост и развитие микроорганизмов внешних факторов. В этом плане особый интерес представляют продукты жизнедеятельности микробных клеток. Добавленные в среду культивирования в определенных концентрациях, они участвувт в регуляции численности популяции (Коротяев 1973; Шигаева и др., 1986].
Широко известно, что на размновение клеток оказывают влияние многие биологически активные вещества, обладавшие мутагенным или ДНК-поврездающим действием. Эти вещества в микродо-эах стимулируют рост и развитие клеток, индуцируют репликатив-ный синтез ДНК (Conn et al.. І984; . иваницкая с соавт. 1986; Шангин-Барезовский и др., 1986). По мнению авторов, в основе стимуляции клеточной пролиферации мутагенами леаат модификаци-онные события, приводящие к увеличению активности внутриклеточных нуклеодеполимераз, в том числе и рибонуклеаз (РНКаз). Активация щелочной РНКазы мутагенами была показана авторами в модельных экспериментах и опытах la vitro. Наблыдаемый факт корреляции усиления пролиферативных процессов с повышением активности РНКаз определяет интерес к этим ферментам в плане исследования роста и развития культур микроорганизмов при непосредственном воздействии на.них экзогенными РНКазами. Изучение этих вопросов будет способствовать познанию фундаментальных закономерностей, леващих в основе регуляции клеточного роста и деления. Помимо этого, результаты исследования роста микроорганизмов в присутствии экзогенных РНКаз могут позволить реиить ряд конкретных задач биотехнологии, таких,как увеличение выхода биомассы практически ценных микроорганизмов и продуктов их
_ 3 -
метаболизма.
Среди первых работ, посвященных изучению влияния экзогенных РНКаз на пролиферативные процессы, заслуживают внимания испытания их в ферментотерапии опухолей. Было показано, что нуклеодеполимеразы ыикробной и тканевой природы наряду с распадом опухолей визываот стимуляция роста клеток карциномы Эр-лиха особенно в опытах с резко сниженным (на 5-6 порядков) количеством введенного фермента (Кине и др., 1988; Беляева и др., 1969; Габдуллина. 1980).
Вместе с тем в литературе имелись единичные сообщения о стимулирующем влиянии панкреатической РНКазы на размноіение ряда бактериальных клеток (Солдатова. Беляева, 19?2). Однако к началу настоящей работы (1988) в литературе отсутствовала информация о возыокнах механизмах действия экзогенных РНКаз, в том числе о способности этих ферментов проникать в микробные клетки. Все это не позволяло однозначно оценить вклад, который вносят РНКазы в процессы регуляции роста и развития культур микроорганизмов, для решения этого вопроса необходимо значительное накопление экспериментальных данных о действии экзогенных РНКаз на рост и развитие микробных культур с учетом таких факторов, как каталитическая активность ферментов. Физиологическое состояние и проницаемость микробных клеток для РНКаз.. Все излоаенное свидетельствует об актуальности изучения маханизмоз регуляции разынокения микроорганизмов с участием экзогенных РНКаз.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось выяснение основных закономерностей влияния экзогенных РНКаз на клетки дровней в связи с регуляторним действием этих ферментов на рост и развитие микроорганизмов.
В задачи экспериментальных исследований входило: .
і. Изучение влияния экзогенных РНКаз на размножение аспо-рогенных дрожжей в зависимости от физиологического состояния инокулята и активности рибонуклеаз.
-
Определение возможности проникновения экзогенных РНКаз в клетки дрожией.
-
Изучение влияния экзогенных РНКаз на биосинтетические процессы в клетках дрожжей.
-
Рассмотрение биохимических аспектов стимулирующего
- ч -
действия РНКаз.
5. Разработка способов применения экзогенных РНКаз в качестве стимуляторов роста культур микроорганизмов и растений.
Научная нозиэна работы. Впервые збнарумена способность экзогенных РНКаз (РНКаза 1, РНКаза B.intermedius ^отличающихся по свойствам . оказывать регуляторное действие на рост культуры аспорсгенных дроааей рода Candida.
Установлено, что РНКазы при добавлении их в начале лаг-Фазы роста культуры в высоких концентрациях угнетают рост и деление клеток, а в низких дозах стимулируют эти процессы.
Подобраны оптимальные условия для проявления стимулирующего эффекта РНКаз: доза фермента, добавляемого в среду культивирования, и фаза роста культуры, используемой в качестве инокулята. При этом установлено, что стимулирующая доза РНКазы является строго определенной, при отклонении от нее в сторону увеличения или уменьшения эффект ускорения размновения клеток уменьшается или полностью утрачивается.
Впервые показано, что стимулирующий эффект обусловлен избирательным влиянием РНКаз на активно размногавщиеся клетки культуры экспоненциальной фазы роста, коррелирующий со стимуляцией синтеза РНК и белка и с повывением активности хрсмаги-нассоциированной РНК-полимеразы.
С помодьга иммунохимических методов исследования установлена избирательность поступления экзогенных РНКаз (нативных и инактивированных) в клетки, достигшие фазы замедления роста.
Обнаружено изменение параметров ионного гоиеостаза у клеток дровжей, подвергнутых действии экзогенных РНКаз. Установлено, что-под действием РНКаз происходит изменение активности мембранного фермента аденилатциклазы с последующим изменением содержания уровня цйМФ и активности цнНФ-зависимых протеикки-наз у дроажей C.tropicalis.
Практическое значение работы. Разработаны способы выращивания культур бактерий, дроааей, а такае ряда растений при добавлении в ростовую среду в малых дозах РНКаз. Способы могут быть использованы при разработке более эффективных технологий получения микробной биомассы для медицинской, пищевой промышленности, для сельского хозяйства, в частности при получении кормовых белковых концентратов и создании средств зациты сель-
скохозяйственных растений.
Апробация работы. Основные полонения диссертационной работы доловены на Всесовзных конференциях "Регуляция микробного метаболизма" С [Гущино, 1989). "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Структура и Функция клеточного ядра" (Гродно. 1990). Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения Ферментов" (Рига, 1990). 9 конференции межотраслевого проекта "Ферменты "микроорганизмов" (Казань, 1991).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них - 4 авторских свидетельства.
Объем и стрнктара работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав обзора литературы. 5 глав собственных исследований и раздела "Материалы и методы исследований", закличения, выводов и списка литературы. Материалы иэлонены на 167 страницах машинописного текста, вклачая 25 таблиц и 11 рисунков. Список литературы содержит 125 отечественных и 137 иностранных авторов.