Введение к работе
Актуальность проблемы. Биологическая фиксация азота атмосферы второе десятилетие остается проблемой, значение которой все возрастает и выходит далеко !а рамки биологии и сельского хозяйства. Причин тому много: производство минеральных удобрений потребляет до трети энерпш, выделяемой на сельское тозяйство в развитых странах, в том числе и у нас в стране, а применение - ведет к :ерьезному загрязнению окружающей среды, ухудшению качества сельскохозяйственной продукции, росту заболеваемости и смертности людей и кивотных, снижению почвенного плодородия (Черемисов, 1988; Шумный и др., 1991).
Именно по этим причинам во многих странах мира возросло внимание к «пользованию биологического азота в земледелии. Это связано с полной 5езвредностью процесса азотфиксации для человека и окружающей среды и гпюсительно небольшими затратами энергии на активизацию микроорганизмов, )существляющих этот процесс.
В настоящее время наметилось 2 основных пути усиления азотфиксации в цроэкосистемах: первый - активизация деятельности естественной популяции ізотфиксирующих микроорганизмов в ризосфере и на корнях; второй - инокуляция истений активными штаммами диазотрофов.
Общепризнанным является тот факт, что за счет нитрагинизации бобовые іастения могут существенно улучшить свое минеральное питание, повысить 'стойчивость к фитопатогенным микроорганизмам и даже регулировать свое швитие за счет использования гормональных факторов или витаминов, :интезируемых микросимбионтами.
Сегодня во многих странах мира на основе активных штаммов клубеньковых іактерий широко налажено производство высококачественных экологически чистых їиоудобрений (Smith, 1992).
Как показала практика, относительно высокая продуктивность агроэкосистем іри возделывании многих сельскохозяйственных культур достигается внесением шнерального азота в концентрации 60-90 кг/га и более в зависимости от исходного «держания в почве его легкогидролизуемых форм. Использование препаратов лубеньковых бактерий снижает эту норму на 60-100% (Патыка и др.,1993).
Вместе с тем интенсификация сельскохозяйственного производства гредусматривает разработку и внедрение все новых и прогрессивных экологически
безопасных приемов повышения урожайности растений. Одним из таких способов, повышающих эффективность бобово-ризобиального симбиоза, может быть применение регуляторов роста и развития микроорганизмов, которые могут активно влиять на жизнедеятельность клубеньковых бактерий и тем самым позволят максимально реализовать их потенциальные возможности.
Однако, внедрение синтетических регуляторов роста микроорганизмов в практику тормозится либо из-за высокой их стоимости, либо из-за отсутствия водорастворимых препаративных форм, а также возможности побочных явлений. В этом плане значительный интерес представляют биологические вещества и, в частности, РНКаза бактериального происхождения - экологически безопасный и доступный ферментный препарат.
К началу наших исследований было известно, что экзогенные РНКазы оказывают стимулирующее влияние на размножение бактерий и усиление способности продуцировать биологически активные вещества (Егоров и др., 1994; 1997; Куприянова-Ашина и др., 1995)
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование действия РНКазы Bacillus intermedius на жизнедеятельность и симбиотические свойства клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti.
В связи с поставленной целью в работе решались следующие задачи:
-
Исследовать действие РНКазы В. intermedius на рост R. meliloti и способность их продуцировать биологически активные соединения.
-
Изучить влияние фермента на азотфиксирующую активность ризобий в чистой культуре и в модельной сим биотической системе.
-
Исследовать влияние РНКазы на размножение R. meliloti в почвенных условиях.
4. Определить возможность использования РНКазы для повышения
эффективности бобово-ризобиального симбиоза и увеличения урожая люцерны.
Научная новизна работы. Впервые обнаружена способность РНКазы В. intermedius оказывать стимулирующее действие на рост и размножение симбиотических азотфиксирующих микроорганизмов R. meliloti. Установлено, что РНКаза в низких дозах стимулирует размножение ризобий независимо от фазы роста популяции. Максимальный эффект РНКазы проявляется в концентрации 0,01мкг/мл/10 клеток при засеве среды культурой экспоненциальной фазы роста. Показано, что клубеньковые бактерии синтезируют биологически активные вещества только в фазу замедления роста и стационарную фазу. Добавление РНКазы
5 j фазу замедления роста культуры усиливает биологическую активность ризобий, гго выражается в повышении энергии прорастания семян, всхожести и накоплении лассы проростками люцерны. Установлено, что микробная РНКаза обладает ;пособностью стимулировать выход витаминов пиридоксина и тиамина, а также іеществ фитогормонапыюй природы, в частности индолилуксусной кислоты. Токазана возможность усиления антагонистической актшвности клубеньковых 5актерий, обработанных РНКазой, в отношении фитопатогешшх микромицетов.
Установлено, что в стерильной почве РНКаза стимулирует рост R. meliloti. В іестерильной почве под воздействием фермента увеличивается выживаемость отубеньковых бактерий, что приводит к сокращению периода адаптации и к более їьістрой стабилизации численности популяции.
Впервые выявлено усиление нигрогеназной активности ризобий в присутствии микробной РНКазы в чистой культуре. В вегетационных опытах под действием фермента показано усиление симбиотических свойств R. meliloti, что проявляется в 'величении количества корневых клубеньков, в повышении азотфиксирующей наивности и в увеличении урожая надземной массы растений. Впервые для иубеньковых бактерий в условиях полевого опыта продемонстрирована юзможность целенаправленного повышения урожая люцерны путем предварительной обработки ризобий РНКазой.
Практическая значимость работы. Нами разработан способ изготовления шзоторфина в совхозе «Казанский Тепличный» Республики Татарстан на основе итаммов клубеньковых бактерий, активируемых РНКазой Bacillus intermedius, юзволяющий увеличить титр клеток и сохранить его достаточно высоким в течение 15 дней. Полевые испытания на дерново-подзолистой почве совхоза «Новая жизнь» 'еспублики Татарстан показали, что инокуляция семян люцерны клубеньковыми їакгериями, обработанными рибонуклеазой, увеличивала урожай и содержание шрого протеина в растениях. В диссертации имеются акты производственных [спытаний, подтверждающие положительный эффект действия РНКазы.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 16-ом Леждународном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Индия, Дели, 994), на Международном симпозиуме «Органическое вещество торфа» Белоруссия, Минск, 1995), на Ш Международной конференции «Регуляторы роста і развития растений» (Россия, Москва, 1995), на 7 Европейском конгрессе по іиотехнологии (Франция, Ницца, 1995), на конференции по биотехнологии для ельского хозяйства (Италия, Феррара, 1995), на 7 международном симпозиуме по
6 экологии микроорганизмов (Бразилия, Сантос, 1995), на итоговых научны конференциях Казанского государственного университета (1994, 1995,1997,1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 115 страница? состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследованиі раздела собственных иследований, обсуждения результатов, выводов и списк литературы. Работа содержит 15 таблиц, 10 рисунков. Список литературы содержи 129 отечественных и 79 зарубежных авторов.