Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Альдоксим-нитрильный метаболизм почвенных бактерий 12
1.1. Ключевые ферменты альдоксим-нитрильного метаболизма 14
1.1.1. Классификация и характеристика альдоксимдегидратаз 15
1.1.2. Классификация и характеристика нитрилгидратаз
1.2. Молекулярные основы метаболизма нитрилов 20
1.3. Микроорганизмы, утилизирующие азотсодержащие производные карбоновых кислот 26
1.4. Методологические подходы и методы оценки структурно-функционального состояния почвенной микробиоты
1.4.1. Бактериологические методы 30
1.4.2. Молекулярно-генетические методы 31
Экспериментальная часть 37
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 37
2.1. Выделение бактериальных культур 37
2.2. Условия культивирования бактерий 39
2.3. Трансформация субстратов 39
2.4. Определение общей токсичности почвы 40
2.5. Определение токсичности нитрилов
2.5.1. Биотестирование 41
2.5.2. Оценка минимальных подавляющих и бактерицидных концентраций токсикантов 42
2.5.3. Атомно-силовая и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 42
2.6. Модельный эксперимент по влиянию акрилонитрила на почвенную
микробиоту з
2.7. Выделение ДНК 44
2.7.1. Выделение ДНК из клеток бактерий 44
2.7.2. Выделение тотальной ДНК из почвы 45
2.8. Полимеразная цепная реакция 46
2.8.1. ПЦР с детекцией по конечной точке 46
2.8.2. ПЦР в реальном времени 49
2.9. Определение нуклеотидной последовательности генов универсальной 16S
рРНК и функциональных генов 50
2.10. Метагеномный анализ 51
2.11. Статистическая обработка 51
ГЛАВА 3. Распространение альдоксим-нитрилутилизирующих микроорганизмов в почвах с разной антропогенной нагрузкой 53
3.1. Распространение бактерий, обладающих системами трансформации нитрилов, в почвах умеренной и степной зон 53
3.2. Биоиндикация почвенной среды с использованием нитрилутилизирующих бактерий 57
3.3. Активность ферментов альдоксим-нитрильного метаболизма почвенных штаммов бактерий 61
3.3.1. Трансформация ряда субстратов 62
ГЛАВА 4. Генетическая характеристика альдоксимдегидратазы и нитрилгидратазы 70
4.1. Детекция генов, кодирующих ферменты альдоксим-нитрильного метаболизма 70
4.2. Характеристика альдоксимдегидратаз штаммов Rhodococcus 74
4.3. Характеристика нитрилгидратаз штаммов Rhodococcus 76
ГЛАВА 5. Изучение структуры микробного сообщества загрязненных почв 86
5.1. Микробиота почв с разной антропогенной нагрузкой 86
5.2. Модельный эксперимент по влиянию акрилонитрила на почвенную микрофлору 89
5.3. Метагеномное секвенирование 99
ГЛАВА 6. Влияние синтетических нитрилов на морфологию и жизнеспособность некоторых видов бактерий 102
6.1. Влияние субстратов на жизнеспособность бактерий 102
6.2. Микроскопические методы оценки токсичности нитрилов 107
Заключение 114
Выводы 121
Список сокращений 122
Список литературы 123
- Методологические подходы и методы оценки структурно-функционального состояния почвенной микробиоты
- Определение общей токсичности почвы
- Активность ферментов альдоксим-нитрильного метаболизма почвенных штаммов бактерий
- Характеристика альдоксимдегидратаз штаммов Rhodococcus
Введение к работе
Актуальность исследования и состояние вопроса
Нитрилы карбоновых кислот (цианиды) – органические вещества, содержащие одну или несколько цианогрупп –CN, связанных с углеводородным радикалом. Синтетические нитрилы являются важными промежуточными продуктами при синтезе аминов, амидов, амидинов, карбоновых кислот, сложных эфиров, альдегидов, кетонов и гетероциклических соединений (Banerjee et al., 2002). В течение нескольких десятилетий нитрилы попадали в окружающую среду с промышленными сточными водами и сельскохозяйственными гербицидами (Vosahlova et al., 1997; Reinnicke et al., 2012). Важнейшим фактором детоксикации нитрильных загрязнений и перспективным объектом для локальной очистки стоков являются микроорганизмы. Бактерии, утилизирующие нитрильные соединения, были выделены из мелководных морских отложений (Langdahl et al., 1996), глубоководных донных осадков (Colquhoun et al., 1998; Heald et al., 2001), геотермальных источников (Yamaki et al., 1997; Pereira et al., 1998) и из различных почв (Martinkova et al., 1992; Layh et al., 1997; Забазная и др., 1998; Kato et al., 2000; Brandao et al., 2003; Максимов и др., 2007). Тем не менее, в доступной литературе нет данных о встречаемости данной группы прокариот в различных типах почв, в том числе с антропогенной нагрузкой.
Описаны бактериальные системы гидролиза нитрильных соединений, которые конвертируются в соответствующие карбоновые кислоты путем сочетанного действия нитрилгидратазы и амидазы или при работе фермента нитрилазы (Kobayashi et al., 1992). Нитрилгидратаза имеет большое практическое значение в качестве биокатализатора для промышленного производства акриламида и никотинамида (Yamada, Kobayashi, 1996; Raj et al., 2006; Дебабов, Яненко, 2011; Rucka et al., 2014), а также для биоремедиации окружающей среды (Wyatt, Knowles, 1995; Holtze et al., 2008). Большая часть штаммов-суперпродуцентов нитрилгидролизующих ферментов изолирована из почвенной среды, но оценка активности почвенной микробиоты в контексте биокаталитического и биодеструктивного потенциала не проводилась.
Выделены и охарактеризованы альдоксимдегидратазы, нитрилгидратазы и
амидазы из клеток разных микроорганизмов (Nishiyama et al., 1991; Астаурова и др.,
1993; Kato, Asano, 2006; Prasad, Bhalla, 2010). Несмотря на то, что у представителей
одного таксона выявляется высокая гомология этих ферментов, субстратная
специфичность их может существенно варьировать, что обусловлено
аминокислотными заменами, в том числе в локусах, не связанных с активным центром фермента (Brandao et al., 2003 Martnkova et al., 2010).
Известно, что вещества с цианогруппой существенно изменяют состав и
структуру почвенного микробного сообщества (Baxter et al., 2006; Pampulha, Oliveira,
2006). Большая часть таких исследований была посвящена влиянию на микробиоту
нитрильных гербицидов, а методология ограничивалась традиционным
культуральным методом либо с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза (Baxter, Cummings, 2008) тогда как на современном этапе для
комплексной оценки видового разнообразия почвенных микроорганизмов широко используются другие молекулярно-генетические технологии – полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР РВ) и метагеномное секвенирование (Андронов и др., 2012; Whiteley et al., 2012).
Нитрилы являются тканевыми ядами и, подобно цианидам, блокируют действие одного из ферментов дыхательного пути – цитохромоксидазы (Luque-Almagro et al., 2005). До сих пор остается малоизученным вопрос о влиянии нитрилов на жизнеспособность и поверхностные структуры бактериальных клеток. Подходы, основанные на биолюминесценции, определении минимальных подавляющих и бактерицидных концентраций (МПК, МБК) для бактериальных тест-штаммов при их экспозиции с растворами токсикантов, являются методически и экономически привлекательными и сертифицированы во многих странах (Данилов и др., 2002; Методика определения …, 2010; Palma et al., 2010), но не применяются для тестирования нитрильных соединений. Использование конфокальной лазерной сканирующей (КЛСМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) для изучения морфо-функциональных особенностей бактериальных клеток при воздействии различных факторов, является актуальным направлением развития современных методов микробиологического анализа (Stoderegger, Hernd, 2004; Феофанов, 2007; Nikiyan et al., 2010; Kuyukina et al., 2014; Ерохин, 2015).
Цель: изучение распространенности нитрилутилизирующих микроорганизмов в почвах с разной антропогенной нагрузкой и влияния синтетических нитрилов на почвенные бактерии с помощью традиционных и высокотехнологичных методов микробиологического анализа.
Задачи исследования:
-
Проанализировать встречаемость/распространенность альдоксим- и нитрилутилизирующих микроорганизмов в почвах с разной антропогенной нагрузкой и оценить возможность их использования в качестве индикатора загрязнения окружающей среды.
-
Определить генетическое разнообразие ключевых ферментов альдоксим-нитрильного метаболизма бактерий рода Rhodococcus.
-
Изучить влияние различных концентраций акрилонитрила на численность и структуру почвенного микробного сообщества в модельном эксперименте in vitro.
-
Оценить токсическое действие синтетических нитрилов и нитрильных гербицидов на морфологию и жизнеспособность некоторых видов бактерий.
Научная новизна
Впервые дан сравнительный анализ распространенности
нитрилутилизирующих микроорганизмов, активности и генетического разнообразия ключевых ферментов альдоксим-нитрильного метаболизма бактерий, изолированных из природных и антропогенно-загрязненных почв. Показана более высокая гетерогенность нитрилгидратаз у штаммов бактерий рода Rhodococcus, выделенных
из антропогенно-измененных почв, и обнаружена радикальная замена в
последовательности -субъединицы нитрилгидратазы штамма R. erythropolis Б4-4,
изолированного из почвы с территории предприятия по производству акриламида.
Впервые в условиях модельного эксперимента проведен комплексный анализ влияния
различных концентраций нитрила акриловой кислоты на численность и структуру
микробного сообщества природной почвы с помощью бактериологического и
молекулярных методов – ПЦР РВ и метагеномного секвенирования. Показано
угнетение развития практически всех физиологических групп бактерий высокими
(2000 мг/кг) концентрациями нитрила, тогда как при 200 мг/кг на фоне общего
снижения количества бактерий происходит стимулирование нитрилутилизирующих
прокариот. Несмотря на колебания численности представителей - и -Proteobacteria,
Acidobacteria и Actinobacteria, качественный состав микробиоты изменяется только
на уровне классов и семейств. Определена токсичность широкого ряда нитрилов и
нитрильных гербицидов методом биотестирования на основе биолюминесцентного
анализа, а также путем установления МПК и МБК на различные виды бактерий.
Впервые с применением АСМ и КЛСМ оценены выживаемость и морфометрические
характеристики бактериальных клеток Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens,
Rhodococcus ruber при воздействии акрилонитрила и бромоксинила в
суббактерицидных и бактерицидных концентрациях. Установлено, что для прокариот токсичность нитрилов обусловлена не только инактивацией фермента дыхательной цепи, но и выраженными повреждениями клеточной стенки, при этом влияние ароматических гербицидов более выражено, чем алифатических.
Научно-практическая значимость работы
Результаты выполненного исследования расширяют представления о встречаемости бактерий, обладающих системами трансформации альдоксимов и нитрилов карбоновых кислот, в почвах, характерных для Пермского края и умеренной степной зоны. Проведена оценка возможности использования данной группы прокариот в качестве биоиндикатора загрязнения окружающей среды. Показан биодеструктивный и биокаталитический потенциал штаммов, выделенных из антропогенно-загрязненных почв. Секвенированы гены альдоксимдегидратаз и нитрилгидратаз некоторых почвенных штаммов. Проанализирована структура и динамика почвенного микробиома при загрязнении различными концентрациями акрилонитрила. Результаты модельного эксперимента дополняют знания об адаптационном потенциале микробиоты незагрязненных почв и помогают устанoвить закономернoсти oтвета природных сообществ на специфические зaгрязнeния. Проведена оценка влияния нитрилов и нитрильных гербицидов на жизнеспособность и морфологию некоторых видов микроорганизмов. Устойчивость бактерий к суббактерицидным концентрациям нитрилов штаммоспецифична и связана с уровнем активности и субстратной специфичностью нитрилгидролизующих ферментов. Токсическое действие высоких концентраций нитрилов обусловлено, в большей степени, повреждением клеточной стенки. Комплексный подход с использованием
традиционных и новых технологий микробиологического анализа позволил оценить влияние нитрилов на бактерии на популяционном и клеточном уровне.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Бактерии, обладающие системами трансформации нитрилов, распространены повсеместно с преобладанием в антропогенно-измененных почвах и могут отражать нитрильное загрязнение последних. Активность ферментов нитрильного метаболизма у почвенных микроорганизмов убывает в ряду: амидаза, нитрилгидратаза, альдоксимдегидратаза. Выделенные из промышленных почв штаммы бактерий характеризуются более высокой активностью нитрилгидратазы.
-
Внесение в почву акрилонитрила вызывает изменения в структуре почвенного сообщества, которые, в первую очередь, проявляются в колебании численности представителей - и -Proteobacteria и пролонгированном угнетении бактерий филы Acidobacteria. Наиболее устойчивыми к влиянию поллютанта являются Bacteroidetes и Fungi.
-
Ароматические нитрилы, в том числе гербициды, являются для бактерий наиболее токсичными из рассмотренных субстратов, что обусловлено не только инактивацией фермента дыхательной цепи, но и выраженными повреждениями клеточной стенки.
Публикации и апробация работы
По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах из списка ВАК.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на II, IV, VI Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз – Россия» (Пермь, 2009; Воронеж, 2011; Иркутск, 2013); V Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2009; Региональной студенческой научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии», Пермь, 2010; 18-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2014; II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2015.
Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 36 рисунков и 20 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает 190 наименований работ, в том числе 42 отечественных и 148 зарубежных автора.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации
органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер
государственной регистрации 0120.0406511). Исследования поддержаны
программами Президиума РАН «Биологическое разнообразие» (№ 2.1.1.6252), «Молекулярная и клеточная биология» (№ 2.1.1/12133), финансируемыми УрО РАН, грантом РФФИ 13-04-96050-р_урал_а, а также научным проектом молодых ученых УрО РАН 14-4-НП-218. Научные положения и выводы полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
Автор благодарит за предоставленную возможность совместных исследований и содействие в работе сотрудников и заведующих лабораториями: чл.-корр., д.б.н., профессора Ившину И.Б., д.м.н., профессора Ширшева С.В. и к.г-м.н. Шишкина М.А.
Методологические подходы и методы оценки структурно-функционального состояния почвенной микробиоты
Ферменты активны при нейтральной рН, и оптимум температуры большинства около 30С. В то же время альдоксимдегидратаза P. сhlororaphis B23 была наиболее активна при рН 5,5, а оптимум температуры – 45С (Oinuma et al., 2003). У другой псевдомонады температурный оптимум фермента составляет 20 С.
Остается открытым вопрос о субстратной специфичности альдоксимдегидратаз. Все описанные ферменты способны конвертировать фенилацетальдоксим (Kato et al., 2000). Одновременное сочетание фенилацетальдоксим- и пиридин-3-альдоксимдегидратазной активности не проясняет, связано ли это с тем, что один фермент может трансформировать несколько субстратов, или возможно существование в штамме двух или больше энзимов. Альдоксимдегидратаза Rhodococcus sp. N-771 предпочтительно действовала на алифатические субстраты. Альдоксимдегидратаза Pseudomonas sp. K-9 конвертировала как алкильные альдоксимы, так и арилалкильные субстраты, но детальная характеристика фермента позволила определить его в группу алифатических альдоксимдегидратаз (Kato, Asano, 2006). Наилучшим субстратом для альдоксимдегидратазы P. chlororaphis B23 был бутиральдоксим, который трансформировался в бутиронитрил (Oinuma et al., 2003). Интересно, что для нитрилгидратазы данного штамма бутиронитрил также являлся наиболее предпочтительным субстратом (Km=1,03 мМ) (Nagasawa et al., 1987).
Kato и соавт. (2000) обнаружили, что все нитрилутилизирующие микроорганизмы обладали альдоксимдегидратазной активностью при условии, что они культивировались с альдоксимом (Kato et al., 2000). Сделано предположение, что альдоксимдегидратаза индуцибельна, и индуктором ее активности служат сами субстраты. Также авторы обнаружили, что альдоксимы являются хорошими индукторами не только для альдоксимдегидратазы, но и для других нитрилгидролизующих ферментов. 1.1.2. Классификация и характеристика нитрилгидратаз
С момента открытия нитрилгидратазы Arthrobacter sp. J-l (Asano et al, 1980) подобные ферменты выделены и описаны у различных бактерий. В настоящее время у микроорганизмов идентифицировано два типа нитрилгидратаз, различающихся простетическими группами (ионы железа или кобальта). Железосодержащие ферменты встречаются чаще и были описаны первыми. Ионы кобальта обнаружены в нитрилгидратазах штаммов R. rhodochrous J1, М8, P. putida 5B и В. smithii SC-J05-1 (Астаурова и др., 1993; Takashima et al, 2000; Рогачева, Игнатов, 2001). Нитрилгидратаза из Agrobactenum tumefaciens В-261 содержит и ионы кобальта, и ионы железа. Также выделен фермент Myrothecium verrucaria, содержащий в активном центре ионы цинка. Недавно обнаружена нитрилгидратаза, содержащая один ион кобальта, два - меди и один -цинка на одну молекулу функционального белка, однако расположение этих четырех ионов металлов в ферменте неизвестно (Okamoto, Eltis, 2007).
Исследована структура нитрилгидратаз, выделенных из различных микроорганизмов. Нативные четвертичные структуры бактериальных нитрилгидратаз высоко вариабельны. Их молекулярная масса варьирует от 54 до 530 кДа (Prasad, Bhalla, 2010). За исключением гомотетрамерного фермента из A. tumefaciens d3 (Bauer et al., 1994), все остальные известные нитрилгидратазы являются аР-гетеромультимерами, обычно димерами или тетрамерами. Обе субъединицы необходимы для проявления активности фермента. Молекулярная масса а-субъединицы составляет от 24 до 28 кДа, -субъединицы - 25-39 кДа. У штамма R. rhodochrous J1 обнаружено образование двух видов нитрилгидратаз: высокомолекулярной, Mr 520 кДа, и низкомолекулярной, Mr 130 кДа. Низкомолекулярная нитрилгидратаза R. rhodochrous J1 имеет а2р2 нативную структуру белка, в отличие от осюрю структуры высокомолекулярной нитрилгидратазы. Оба фермента являются кобальтзависимыми. Молекула аР-гетеродимера содержит 1 атом кобальта, в отличие от железосодержащих нитрилгидратаз, где 1 атом железа приходится на каждую субъединицу фермента (Kobayashi et al., 1991).
Нитрилгидратазы в значительной степени различаются по физико химическим свойствам и субстратной специфичности. Железосодержащие нитрилгидратазы гидратируют преимущественно алифатические короткоцепочечные нитрилы. Кобальтсодержащие ферменты имеют более широкий спектр субстратной специфичности и способны конвертировать также ароматические нитрилы (Cowan et al.,1998; Martnkova et al., 2010).
Большинство нитрилгидратаз термолабильны, их операционный температурный оптимум варьирует от 20 до 35С. Это позволило проводить реакции биосинтеза амида при низких ( 25С) температурах, при которых амидазная активность практически не регистрируется (Sharma et al., 2009). В то же время описано несколько ферментов с максимальной активностью при 40, 50 и даже 60С (Yamaki et al., 1997; Cramр, Cowan, 1999; Kato et al., 1999). pH-оптимум большинства нитрилгидратаз варьирует в пределах от 6,5 до 8,5 (Prasad, Bhalla, 2010). Тогда как кобальтсодержащая нитрилгидратаза, выделенная из термофильной B. smithii SC-J05-1, имеет наибольшую активность при рН более 10,0 (Takashima et al., 2000).
Определение общей токсичности почвы
Бактерии выращивали в 100 мл среды N в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, либо в 40 мл среды в конических колбах объемом 100 мл на роторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью вращения 120 об./мин и температуре 28С в периодическом режиме. Источником углерода служила глюкоза в конечной концентрации 0,1%, источником азота - NH4CI в концентрации 10 мМ. Ацетамид (10 мМ) добавляли как индуктор нитрилгидратазы, а Na2S03 (5 мМ) - альдоксимдегидратазы.
Накопление биомассы контролировали на фотоэлектроколориметре КФК-3 (Россия) с использованием 0,5 см кюветы при А,=540 нм с учетом разведения. Одна единица ОП540 соответствует 0,42±0,12 мг сухого веса клеток Rhodococcus и 0,21±0,07 мг сухого веса клеток Pseudomonas. Активность нитрилгидратазы измеряли на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro (Англия) по изменению оптической плотности реакционной среды при .=240/260 нм с добавлением 15 мкл акрилонитрила на 4 мл пробы в течение одной минуты с использованием кварцевой 1 см кюветы.
Бактериальную суспензию, отобранную в конце экспоненциальной фазы (ОП54о=1,5-2,0), откручивали на центрифуге Heraeus Biofuge Stratos (Thermo scientific, Германия) 20 мин при 9 тыс. об./мин и ресуспендировали в 10 мМ калий-натрий фосфатном буфере следующего состава (г/л): КН2РО4 - 13,6, Na2HP04 12Н20 - 35,82, рН 7,2.
Часовую конверсию акрилонитрила и 3-цианопиридина с использованием биомассы клеток осуществляли в объеме 1,0 мл в пробирках эппендорф. Реакцию проводили одновременно в двух температурных режимах: при 25 и 50С для акрилонитрила, при 30 и 50С для 3-цианопиридина в твердотельном термостате «Термит» (ДНК-Технология, Россия). Трансформацию пропионитрила осуществляли в объеме 5 мл при температуре 30С. Пробы отбирали каждые 10 мин, добавляли 50 мкл концентрированной HCl для остановки реакции и центрифугировали (5415 D, Eppendorf, Германия) при 12 тыс. об./мин в течение 3 мин.
В 24-часовом синтезе акриламида, пропионамида и никотинамида пробы отбирали каждый час по 200 мкл, центрифугировали при 12 тыс. об./мин в течение 3 мин, супернатанты использовали для анализа субстратов и продуктов. Во всех вариантах субстраты добавляли дробно по мере их трансформации, не превышая концентрацию 3%.
Биотрансформацию пропиональдоксима проводили в 5 мл фосфатного буфера в течение 1-24 часов. Пробы отбирали по 100 мкл, центрифугировали при 12 тыс. об./мин в течение 3 мин.
Количественный анализ алифатических предельных и непредельных субстратов и продуктов осуществляли методом газовой хроматографии (Shimadzu GC-2014, Япония). Ароматические органические вещества определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (Shimadzu LC-10, Япония). В качестве стандартов использовали растворы чистых альдоксима, нитрилов, амидов и карбоновых кислот. Удельную активность фермента выражали как количество продукта в мкмоль, образуемое мг сухого веса клеток за минуту (мкмоль/мг/мин).
Общую токсичность почвы оценивали с использованием биолюминесцентного сенсора «Эколюм-5» на основе рекомбинантного люминесцентного штамма E. coli K12 TG1 с полным lux-опероном из Vibrio fischeri, полученного из коллекции МГУ им. М.В. Ломоносова (Данилов и др., 2002). Данный метод является стандартизированным и сертифицированным в России (ПНД ФТ 14.1:2:3:4.11-04, ПНД ФТ 16.1:2:3:4.8-04) и в Европе (ISO 11348-2) (Методика определения…, 2010; Palma et al., 2010). Навеску почвы освобождали от корней, крупных посторонних частиц и высушивали при 105С в течение 1 ч. После охлаждения воздушно-сухую пробу почвы растирали в ступке, просеивали через сито. Навеску почвы (масса не менее 5 г) помещали в коническую колбу, приливали 25 мл дистиллированной воды (рН 6,8-7,4), взбалтывали в течение 5 мин и оставляли для экстракции на 24 ч. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр (белая, красная лента) и тестировали на токсичность (Определение токсичности…, 1996).
Для реконструкции тест-системы «Эколюм-5» добавляли 10 мл дистиллированной воды комнатной температуры (рН 6,8-7,4) во флакон с лиофилизированным сенсором. Выдерживали суспензию в течение 30 мин, периодически перемешивая, и подбирали рабочую концентрацию тест-системы. Опытные пробы разводили в 2, 4, 8, 16 раз. В качестве контроля использовали дистиллированную воду, в качестве модельного токсиканта – ZnSO47H2O 6-7 мг/л. Индекс токсичности (ИТ) рассчитывали по формуле: ИТ = 100(Io-I)/Io, где Io и I соответственно интенсивность свечения сенсора «Эколюм-5» контроля и опыта через 30 мин контакта. В случаях, когда уровень биолюминесценции в анализируемой пробе был больше, чем в контроле, независимо от величины отрицательного значения ИТ делался вывод об отсутствии токсичности образца.
В экспериментах по изучению негативного влияния различных нитрилов на бактерии использовали референтный штамм E. coli K12 TG1 (pBR322) ВКМ (г. Москва), лабораторные штаммы Rhodococcus sp. A0, R. ruber gt1, П5-2, П5-8, R. erythropolis 84, Pseudomonas sp. К15-6-2, К10ж2, P. fluorescens C2.
Оценку токсичности растворов алифатических предельных (ацето-, валеро изобутиронитрил), непредельных (акрилонитрил) и ароматических (бензонитрил, 3,5-дибромо-(бромоксинил), 3,5-дийодо-4-гидроксибензонитрил (иоксинил)) нитрилов (Sigma-Aldrich, США) для бактерий проводили двумя способами. В первом случае применяли подход, основанный на изменении биолюминесценции тест-штамма при его кратковременной экспозиции с растворами токсикантов. Использовали суспензию клеток штамма E. coli K12 TG1 (pXen7), содержащего полный lux-оперон Photorhabdus luminescens размером 7 тыс. п.н. («Эколюм-8») (Данилов и др., 2002). Сенсор добавляли к испытуемым растворам в соотношении
Биолюминесценцию измеряли на многофункциональном микропланшетном ридере BioTek (BioTek Instruments Inc., США). ИТ рассчитывали по вышеописанной формуле. Строили график зависимости уровня биолюминесценции от %-ого содержания нитрилов в двойной логарифмической системе координат и определяли принятый в токсикологии параметр EC50 (median effective concentration). Величина ЕС50 соответствовала концентрации раствора, при которой происходит ингибирование свечения сенсора на 50%. Для сопоставления данных по токсичности использовали показатель LD50 (median lethal dose), указанный в паспортах безопасности нитрилов для крыс (www.sigma-aldrich.com).
Активность ферментов альдоксим-нитрильного метаболизма почвенных штаммов бактерий
Корреляционный анализ в ряду субстратов показал, что нитрилгидратазная и амидазная активности практически не зависят друг от друга у большей части культур. Значимая связь была отмечена между значениями скорости трансформации производных уксусной, пропионовой, масляной и изомасляной кислот в ряду штаммов (R=0,492; 0,474; 0,600; 0,469 соответственно), однако она не всегда была достоверной.
Пропиональдоксим и пропионитрил. Проведена трансформация пропиональдоксима бактериальной биомассой нитрилутилизирующих (R. ruber gt1, Rhodococcus sp. A0) и пропиональдоксимутилизирующих (Pseudomonas sp. 6-1 и 6-5) штаммов (Рисунок 15). Скорость реакции оценивали по убыванию альдоксима в мкмоль на мг сухого веса клеток за час. Показано, что к 30 минуте реакции в среде остается менее 30% количества внесенного субстрата для всех штаммов. Дальнейшее уменьшение альдоксима проходило медленно, но к 5-7 ч он полностью удалялся из среды.
Несмотря на то, что штаммы Pseudomonas sp. 6-1 и 6-5 выделены на альдоксиме, скорость его трансформации этими штаммами была существенно ниже (6,8 и 10,6 ЕД), чем биомассой бактерий – суперпродуцентов нитрилгидратазы R. ruber gt1, Rhodococcus sp. A0 (43,2 и 19,2 ЕД). Необходимо отметить, что в процессе трансформации пропиональдоксима биомассой штаммов Pseudomonas sp. 6-1 и 6-5 в анализируемом супернатанте не было обнаружено продуктов реакции – пропионитрила и пропионовой кислоты. Этот факт может быть объяснен либо внутриклеточным накоплением этого субстрата, либо наличием другого метаболического пути, промежуточные продукты которого не детектируются используемым аналитическим методом. У грамположительных бактерий трансформация пропиональдоксима проходила с образованием соответствующего нитрила, амида и кислоты, что обусловлено работой ферментов альдоксим-нитрильного метаболического пути. Пример суточной конверсии пропиональдоксима биомассой штамма R. ruber gtl представлен на Рисунке 16. Активность альдоксимдегидратазы в среднем составила 0,1-0,3 ЕД (мкмоль пропионитрила на мг сухого веса клеток в минуту).
Конверсию пропионитрила (500 мкмоль) проводили при 30С биомассой клеток штамма R. ruber gtl (3,25 мг сух. веса) в течение 1 часа. К 10 минутам количество пропионитрила в реакционной среде резко сократилось и составило только 10% от количества вносимого субстрата. Дальнейшее убывание субстрата происходило медленно и завершилось к 50-ти мин. Нарастание продукта -пропионамида происходило в течение всего времени и к концу реакции составило 400 мкмоль. Также в супернатанте обнаруживалась пропионовая кислота, количество которой к 60-ти мин составило 50 мкмоль (Рисунок 17). Показано, что нитрилгидратазная активность составила 50-55 ЕД. мкмоль 600
Акрилонитрил. При изучении скорости гидролиза акрилонитрила почвенными штаммами R. ruber gtl, Rhodococcus sp. АО, R. erythropolis К10(Б), К10(О) в двух температурных режимах (25 и 50С) установлено, что акрилонитрил лучше гидратировался нитрилгидратазами первых двух штаммов, при этом наблюдалась более высокая скорость трансформации субстрата при 50С (у R. ruber gtl - более чем в 3 раза). Необходимо отметить, что образовавшийся амид практически не конвертировался в акриловую кислоту, т.к. амидазная активность этих штаммов приближалась к нулю (Таблица 7). Активность нитрилгидратазы штаммов R. erythropolis К10(Б) и К10(О) регистрировалась на очень низком уровне и не превышала 1,5 ЕД при 25 С, при 50С она еще снижалась. В то же время данные штаммы проявляли амидазную активность более 3 ЕД при 25С, которая увеличивалась при повышении температуры. Та блица 7
Так, нитрилгидратазы всех штаммов родококков стабильно работали при 25С в течение всего периода исследования, а при 50С активность снижалась уже после 10 мин реакции. Активность амидаз при 50С была высокой при 10-минутной реакции, однако через полчаса она резко падала. При 25С тенденция к снижению по времени сохранялась.
Хотя к 60-ти минутам активность клеток штамма R. ruber gtl, Rhodococcus sp. А0 при 50С оставалась высокой, накопление акриламида после 30 мин реакции было незначительное. Количество продукта при конверсии акрилонитрила биомассой R. ruber gtl (0,15 мг) при 25С составило 678,9 мкмоль, а при 50С - 535,5 мкмоль, биомассой Rhodococcus sp. А0 (0,2 мг) - 780,5 и 810,0 мкмоль соответственно (Рисунок 19). Учитывая, что к окончанию реакции при 25С происходило нарастание продукта, в последующих экспериментах были увеличены время конверсии и биомасса штаммов.
При 24-часовом гидролизе акрилонитрила с дробным добавлением субстрата с использованием катализаторов R. ruber gt1 (80 мг) и Rhodococcus sp. А0 (70 мг) был получен 37,3 и 40,1% раствор акриламида (в 50 мл среды). Основное количество продукта было накоплено к 9 ч реакции. При этом в обоих случаях активность нитрилгидратаз, измеренная спектрофотометрически, в течение трех часов держалась на высоком уровне (228,41 ЕД для R. ruber gt1 и 212,13 ЕД для Rhodococcus sp. АО), а затем снижалась и составила менее 10% от исходной активности (2,86 и 1,96 ЕД соответственно), что возможно связано с токсическим действием накопившегося акриламида, нельзя исключить и влияние акрилонитрила. Акриловая кислота не обнаруживалась (Рисунок 20).
Динамика трансформации акрилонитрила клетками Rhodococcus sp. А0 при дробном добавлении субстрата (20000 мкмоль). 3-цианопиридин . По отношению к удельной активности нитрилгидратазы при конверсии акрилонитрила, принятой за 100%, относительная ферментативная активность по 3-цианопиридину составила для штамма R. ruber gtl 15,5%, для Rhodococcus sp. АО - 11,3%. Динамика ферментативной активности клеток обоих штаммов при конверсии 3-цианопиридина была аналогичной. Количество образованного за 60 мин никотинамида штаммом R. ruber gtl при 30С составило 115,7 мкмоль, при 50С - 169,6 мкмоль, штаммом Rhodococcus sp. АО - 148,7 и 187,1 мкмоль соответственно.
При суточной конверсии нитрила клетками R. ruber gtl (39,0 мг) концентрация никотинамида к концу эксперимента достигла 3,9%. Биомасса штамма Rhodococcus sp. А0 (39,8 мг) трансформировала 3-цианопиридин в никотинамид, концентрация которого в растворе составила 4,2%. Однако нарастание количества продукта не прекратилось и к 24 ч эксперимента, хотя темп прироста никотинамида существенно снизился (Рисунок 21). Никотиновая кислота определялась в следовых количествах.
Характеристика альдоксимдегидратаз штаммов Rhodococcus
Нужно отметить, что величина EC50 по акрилонитрилу является сильнотоксичной и соответствует 1000 ПДК, установленной для воды. Из рассмотренных нитрилов самыми токсичными были ароматические нитрилы: бензонитрил угнетал биолюминесценцию Е. сoli К12 TG1 на 50% при 0,4 мМ, а его бром- и йодсодержащие производные при концентрациях в 5 и 10 раз меньше: 0,08±0,05 и 0,04±0,01 мМ. Vesela и др. (2010) в своей работе также показали, что иоксинил является более токсичным для бактерий среди нитрильных гербицидов: величина EC50 при использовании биосенсора Vibrio fischeri для бромоксинила и иоксинила составила 14 и 8 нМ соответственно (Vesela et al., 2010). Очевидно, что данный сенсор является более чувствительным к токсикантам, тем не менее Kurvet и др. (2011) при сравнении сенсоров V. fischeri и E. coli, содержащих термостабильную люциферазу из Photorhabdus luminescens, показали, что применение рекомбинантных E. coli является универсальной альтернативой MicrotoxTM теста, использующего в качестве сенсора V. fischeri (Kurvet et al., 2011).
Считается, что тест на общую токсичность химических веществ с использованием люминесцентных бактерий соответствует показаниям EC50 для эукариот. В работе Kaiser K. (1998) показан высокий уровень корреляции между значениями EC50 для V. fischeri NRRL B-11177 тест-системы MicrotoxTM и LD50 для водорослей, дафний, простейших, рыб (Kaiser et al., 1998). При сопоставлении токсикологических параметров EC50 и LD50 оказалось, что для алифатических нитрилов среднелетальная доза была значительно ниже (примерно в 25 раз для акрило- и ацетонитрила), тогда как ароматические нитрилы проявляли большее ингибирующее действие на сенсорный штамм Е. coli К12 TG1, чем на крыс при пероральном введении. Так, показатель LD50 по бензонитрилу был больше EC50 в 23,5 раза, а по бромо- и иоксинилу – в 7,25 и 8,5 раз. Известно, что алифатические предельные и непредельные нитрилы с малой молекулярной массой более токсичны для млекопитающих, чем ароматические соединения, но введение галогенов в циклическую молекулу вещества увеличивает повреждающее действие. При этом их токсичность связана со скоростью образования CN– в макроорганизме и может существенно различаться для разных видов животных (Rao et al., 2013). На дафний изученные нитрилы оказывают еще большее токсическое действие. Поэтому тезис о корреляции между токсикологическими параметрами EC50 и LD50 корректен в отношении не всех нитрильных соединений.
При определении МПК всех групп нитрилов на клетки нитрилутилизирующих микроорганизмов выявлено, что токсичность напрямую зависела от структуры химического вещества: алифатические предельные алифатические непредельные ароматические галогензамещенные ароматические нитрилы (гербициды). При этом для штаммов бактерий с высокой ферментативной активностью для первых трех групп субстратов МПК были не меньше 0,015 М, а для последней разброс составил 0,01-0,3 мМ (Таблица 18, А). В группе штаммов, не обладающих выраженной нитрилгидролизующей активностью, аналогичные показатели составили 7,8 мМ и 0,02-0,078 мМ соответственно. Среди рассмотренных штаммов самым устойчивым к большинству соединений был R. ruber gt1, активность нитрилгидратазы которого достигает 200 ЕД. Отмечено, что разные штаммы родококков могли существенно различаться по устойчивости к нитрилам: МПК бензонитрила для R. ruber gt1, Rhodococcus sp. A0 и R. erythropolis 84 составила 0,06, 0,03 и 0,015 М соответственно. Хотя МПК ряда нитрилов для P. fluorescens C2 были ниже или равны по отношению к родококкам, тем не менее отмечается более высокая устойчивость клеток псевдомонад к бромо- и иоксинилу. Возможно, это связано с естественной резистентностью бактерий рода Pseudomonas для больших молекул активно действующего вещества вследствие непроницаемости клеточной стенки, обусловленной повышенным содержанием ионов магния, что способствует созданию сильных связей между молекулами липополисахаридов (Thomas et al., 2005). Бактерицидные концентрации нитрилов были существенно выше (от 0,125 до 4 М и более для первых трех групп и от 1,25 до 5 мМ для четвертой) и отличались от МПК в 4 раза (P. fluorescens C2, R. erythropolis 84 – для изобутиронитрила), 8 раз (в большинстве случаев) и даже в 33 раза (R. erythropolis 84 – для акрилонитрила, Rhodococcus sp. A0 – для изобутиронитрила). Для гербицидов этот разброс был еще выше.
Устойчивость изученных штаммов бактерий к высоким концентрациям нитрилов объясняется тем, что они были выделены из почв на территории предприятий по производству акриламида, где возможны разливы субстрата и продукта. Нужно отметить, что чувствительность сенсора Е. сoli К12 TG1 и штаммов R. ruber gt1 и Rhodococcus sp. A0 по отношению к субстратам совпала. Исключение составил валеронитрил, EC50 которого оказалась меньше, чем акрилонитрила.