Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Стресс как биологическая функция адаптации и эволюции микроорганизмов 13
1.1 Влияние различных стрессоров на жизнедеятельность микроорганизмов 13
1.2 Роль стрессового воздействия в адаптации и эволюции холерных вибрионов 22
Собственные исследования 30
Глава 2 Материалы и методы 30
2.1 Штаммы 30
2.2 Реактивы, диагностические препараты, дезинфектанты 32
2.3 Оборудование 32
2.4 Питательные среды 33
2.5 Лабораторные животные 33
2.6 Методики создания стресса у холерных вибрионов 33
2.6.1 Методика создания кислотного стресса 33
2.6.2 Методика создания щелочного стресса 35
2.6.3 Методика определения стрессорного влияния желчи 35
2.6.4 Методика создания микроаэрофильного стресса 36
2.6.5 Методика создания температурного стресса 37
2.7 Методики изучения свойств холерных вибрионов 38
2.8 Методика определения уровня токсинопродукции 38
2.9 Методика определения полиамина кадаверина 39
2.10 Методика получения и количественной оценки биопленок холерных вибрионов 40
2.11 Методика определения продукции экзополисахарида 42
2.12 Методика определения антилизоцимной активности 43
2.13 Молекулярно- генетические методы исследования 44
2.14 Статистическая обработка результатов 45
Глава 3 Влияние стрессового воздействия на продукцию холерного токсина 46
3.1 Оценка продукции холерного токсина в опытах, моделирующих воздействие стрессоров на возбудителя холеры в организме человека 46
3.2 Токсинопродукция холерных вибрионов О1 серогруппы в условиях, имитирующих существование в окружающей водной среде 49
3.3 Анализ стабильности генома холерных вибрионов О1 серогруппы в условиях стрессового воздействия 58
Глава 4 Влияние стрессового воздействия на агглютинабельность холерных вибрионов О1 серогруппы 63
4.1 Изучение агглютинабельности холерных вибрионов в опытах, моделирующих воздействие стрессоров в организме человека 63
4.1.1 Изучение влияния гипоксии на антигенные свойства холерных вибрионов 63
4.1.2 Изучение влияния желчи на агглютинабельность холерных вибрионов О1 серогруппы 68
4.1.3 Изучение влияния комбинированного стресса на агглютинабельность холерных вибрионов 69
4.2 Изучение агглютинабельности холерных вибрионов при культивировании в речной воде в условиях температурного стресса и гипоксии 70
Глава 5 Влияние стресса на свойства, обусловливающие персистентный потенциал холерных вибрионов 72
5.1 Влияние стрессового воздействия на образование холерными вибрионами биопленок и продукцию экзополисахарида 72
5.1.1 Образование биопленок в опытах, моделирующих воздействие стрессоров в организме человека 73
5.1.2 Влияние температурного стресса на образование биопленок в опытах, моделирующих условия персистирования холерных вибрионов в речной воде 77
5.2 Изучение влияния стрессоров на продукцию кадаверина холерными вибрионами О1 серогруппы 85
5.3 Влияние стрессового воздействия на антилизоцимную активность 90
5.3.1 Изучение влияния температуры и гипоксии на антилизоцимную активность холерных вибрионов 90
5.3.2 Изучение влияния стрессоров, имитирующих эндогенные факторы желудочно-кишечного тракта на антилизоцимную активность холерных вибрионов 91
Список сокращений 93
Заключение 94
Выводы 105
Приложение 106
Список литературы 115
- Роль стрессового воздействия в адаптации и эволюции холерных вибрионов
- Токсинопродукция холерных вибрионов О1 серогруппы в условиях, имитирующих существование в окружающей водной среде
- Влияние температурного стресса на образование биопленок в опытах, моделирующих условия персистирования холерных вибрионов в речной воде
- Изучение влияния стрессоров, имитирующих эндогенные факторы желудочно-кишечного тракта на антилизоцимную активность холерных вибрионов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Продолжающаяся с 1961 г. и по настоящее
время 7-ая пандемия холеры, обусловленная токсигенными штаммами V.
cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор и появление в 90-х годах прошлого
столетия генетически измененных штаммов, вызвавших интенсивное
распространение холеры в странах Азии и Африки, сохраняет угрозу завоза
инфекции в Российскую Федерацию [Смирнова Н.И. с соавт., 2010, 2011; Nair
G.B. et al., 2002; Faruque S.M. et al., 2007]. Характерной особенностью
возбудителя холеры является чередование его пребывания в инфицированном
макроорганизме с последующим существованием в природных экосистемах.
Смена экологической ниши сопровождается появлением новых или
модифицированных биологических свойств, которые облегчают адаптацию
холерных вибрионов к измененным условиям существования. Биологической
функцией адаптации микроорганизмов является стресс [Титов В.Н., 2010].
Понятием «стресс» определяют общий комплекс неспецифических
компенсаторно-приспособительных процессов, развивающихся у организмов в ответ на воздействие чрезвычайных раздражителей – стрессоров [Баснакьян И.А., 2003]. Основные стрессоры для микробной популяции – высокие или низкие температуры, рН, дефицит железа, отсутствие глюкозы, рост при низком парциальном давлении кислорода.
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время одними из наиболее распространенных неблагоприятных факторов для холерных вибрионов при попадании в организм человека являются кислая среда желудочного сока и воздействие желчи, а при переходе в водную экосистему вибрион испытывает сложности в питании, воздействие необычной температуры и осмомолярности среды [Заднова Н.И. c соавт., 2014; Chatterjee S. et al., 2007; Silva A.J., Benitez J.A., 2016]. Известно, что холерные вибрионы в неблагоприятных условиях (воздействие хлора, кислого или щелочного рН, ультрафиолетового излучения, осмотического и оксидативного стресса) «включают» механизмы множественной стрессорной устойчивости, в частности, экспрессируют ряд белков, продуцируют экзополисахарид, входящий в состав биопленок [Баснакьян И.А., 2002; Шумков М.С., 2007; Ткаченко А.Г., 2010]. При определенных стрессовых условиях происходит модификация генов, ответственных за патогенность и персистенцию [Заднова С.П. с соавт., 2009; Смирнова Н.И. с соавт., 2010,2011; Кульшань Т.А. с соавт., 2015; Плеханов Н.А., 2017].
Влияние стрессового воздействия на биологические свойства холерных вибрионов, их фенотип и генотип изучено недостаточно. В какой степени
возбудитель холеры модифицирует патогенные и культуральные свойства – вопрос остается до настоящего времени практически неизученным. Не изучено, в частности, как влияет кислота желудочного сока, желчь, рН среды, снижение парциального давления кислорода, низкая температура на такие важные свойства как токсинопродукция, агглютинабельность холерными сыворотками и продукция экзополисахарида. Кроме того, у холерных вибрионов есть ряд свойств, которые обусловливают их персистентный потенциал. Это признаки, которые могут играть роль в формировании бактерионосительства и в поддержании жизнеспособности вибрионов в объектах окружающей среды [Бухарин О.В., Дерябин Д.Г., 1997; Балахнова В.В. с соавт., 2010; Коршенко В.А., 2016].
В этой связи особую актуальность приобретает изучение роли стресса в
модификации признаков, участвующих в формировании персистентного
потенциала холерных вибрионов, таких как продукция экзополисахарида
(основы биопленок), антилизоцимная, антикомплементарная,
антилактоферриновая активности, активность антиоксидантных ферментов (каталазы и супероксиддисмутазы).
Изучение влияния различных стрессоров и их комбинаций на такие важные свойства как токсинопродукция, агглютинабельность, а также свойства, обусловливающие персистентный потенциал, актуально и представляет несомненный научный интерес, поскольку может способствовать расширению наших знаний о биологии возбудителя холеры, патогенезе заболевания и решению ряда практических задач при проведении эпиднадзора за этой инфекцией.
Цель исследования: изучить влияния стрессового воздействия на патогенные, культуральные и персистентные свойства холерных вибрионов О1 серогруппы различной эпидемической значимости. Оценить роль отдельных стрессоров в патогенезе и персистенции возбудителя холеры.
Основные задачи исследования:
-
Изучить влияние различных стрессоров на уровень продукции холерного токсина, сравнить их воздействие на типичные штаммы и геноварианты V. cholerae биовара Эль Тор, занесенные на территорию Российской Федерации в 1993-2014 г.г.
-
Изучить влияние моно- и полистрессоров (температуры, кислоты, желчи, высокого рН, микроаэрофильных условий, анаэробиоза) на агглютинабельность холерных вибрионов О1 серогруппы.
-
Оценить влияние стрессовых воздействий на образование биопленок и продукцию экзополисахарида, сравнить роль различных стрессоров на процесс адаптации холерных вибрионов различной эпидемической значимости к
неблагоприятным факторам окружающей среды.
4. Охарактеризовать влияние стрессоров на продукцию кадаверина, рассматриваемого в настоящее время как персистентный фактор у микроорганизмов, и уровень антилизоцимной активности холерных вибрионов О1 серогруппы.
Научная новизна и теоретическая значимость.
- Установлена прямая взаимосвязь воздействия моно- и полистрессоров с
ответной реакцией вибрионов, различающихся по эпидемической значимости.
В опытах, моделирующих воздействие стрессоров на возбудителя холеры в
организме человека, отмечается резкое повышение количества продуцируемого
холерогена; напротив, в речной воде при низкой температуре и гипоксии -
показатели быстро снижаются.
- Показано, что фенотипические изменения уровней токсинопродукции,
коррелирующие в эксперименте со степенью и видом стрессового
воздействия, не сопровождаются утратой профага СТХср, несущего гены,
ответственные за синтез холерного токсина, а также других значимых
участков генома, что подтверждается в полногеномном секвенировании и
INDEL-типировании исходных и стрессированных культур.
- Впервые показано, что холерные вибрионы О1 серогруппы после
стрессового воздействия образуют как внутриклеточный, так и внеклеточный
полиамин кадаверин, количество которого прямо коррелирует с патогенностью
возбудителя холеры, по мере снижения эпидемической значимости вибрионов
отмечается снижение значений суммарной продукции кадаверина: в
микроаэрофильных условиях - с 445,0 мкг/мл у ctx+tcp+ и 435,8 мкг/мл у ctx-
tcp+ штаммов до 292,5 мкг/мл у ctx-tcp- штаммов. Отработан метод
определения полиамина кадаверина у холерных вибрионов и получен патент на
изобретение «Способ определения кадаверина при моделировании стрессовых
ситуаций Vibrio cholerae О1 и О139 серогрупп» RU № 2566558 от 29.09.2015г.
Впервые доказана роль гипоксии в адаптивном изменении антигенного состава холерных вибрионов О1 серогруппы, приводящее к утрате агглютинабельности у 50-70% штаммов, что может вызывать затруднения при идентификации культур и следует учитывать при проведении мониторинга.
Доказана стрессорная роль низкой температуры и гипоксии на процесс выживания и образования биопленок V. cholerae О1, различающихся по эпидемической значимости.
- Установлено влияние стресса на антилизоцимную активность: у
токсигенных штаммов показатели снижались в меньшей степени, чем у
нетоксигенных холерных вибрионов О1 серогруппы.
Научно-практическая ценность работы.
Разработаны, одобрены решением Ученого Совета ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (протокол №12 от 04.12.2014 г.) и утверждены директором института методические рекомендации «Методики создания условий стресса для холерных вибрионов при изучении персистентного потенциала возбудителя холеры». Данные методики используются в НИР ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (акты о внедрении от 22.05.2017 г. и 24.05.2017 г.)
Результаты исследований по определению продукции кадаверина используются при выполнении научных тем ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (акт о внедрении от 19.05.2017г.).
Полученные сведения диссертационного исследования используются при чтении лекций по микробиологии и лабораторной диагностике холеры на курсах дополнительного послевузовского образования при ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Стрессорное воздействие в виде низкой температуры, гипоксии,
кислоты, желчи, высокого рН оказывает выраженное влияние на фенотип
холерных вибрионов О1 серогруппы, заключающееся в вариабельности
токсинопродукции, модификации поверхностных структур,
биопленкообразования, активности факторов, роль которых в персистенции
холерных вибрионов доказана.
2. Стрессовые факторы, имитирующие воздействие на холерные
вибрионы в организме человека, вызывают повышение продукции холерного
токсина, что свидетельствует об активации экспрессии генов ctxAB,
кодирующих основной фактор патогенности. Низкая температура как стрессор,
имитирующий условия окружающей среды в речной воде в холодное время
года, в течение 1-2 месяцев вызывает снижение продукции холерного токсина
вплоть до полной его утраты.
-
Изменения активности изучаемых свойств, связанные со стрессовым воздействием, не связаны с утратой генов, кодирующих продукцию холерогена, экзополисахарида, что подтверждено специальными исследованиями в ПЦР на наличие генов ctxAB, tcpA, vps.
-
В условиях длительной гипоксии холерные вибрионы О1 серогруппы включают механизмы адаптации к действию стрессоров путем модификации поверхностных структур, выражающейся в снижении или утрате агглютинабельности холерными сыворотками, что может вызывать затруднения при идентификации культур.
5. Стресс оказывает влияние на свойства, обусловливающие
персистентный потенциал холерных вибрионов в опытах, моделирующих
условия существования в различных экологических нишах:
биопленкообразование, продукцию полиамина кадаверина, антилизоцимную
активность. Показатели биопленкообразования коррелируют с показателями
выживания холерных вибрионов О1 серогруппы и зависят от эпидемической
значимости штаммов. Уровень антилизоцимной активности зависит от
стрессового воздействия - вызывая в одних случаях повышение, в других –
снижение признака. Количество продуцируемого кадаверина прямо
коррелирует с патогенностью культур и источником выделения штамма.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференциях
молодых ученых ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт
Роспотребнадзора (2011- 2017 гг..), на заседаниях проблемной комиссии
«Холера и патогенные для человека вибрионы» межведомственного научного
совета по санитарно-эпидемической охране РФ (2007 – 2017 гг.), на VII и VIII,
IX Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых и
специалистов Роспотребнадзора «Современные проблемы эпидемиологии и
гигиены» (г. Санкт-Петербург, 2015 г., г. Москва, 2016г., г. Иркутск, 2017 г.),
представлены в материалах научной конференции, посвященной 120-летию ФНЦ
гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (г. Москва, 2011 г.), региональной научно-
практической конференции «Актуальные вопросы эпидемиологии,
микробиологии и диагностики инфекционных и паразитарных заболеваний в
Ростовской области», посвященной 95-летию со дня образования
государственной санитарно-эпидемиологической службы России (г. Ростов-на-
Дону, 2017г.)
Исследования выполнены в рамках двух плановых тем № 0120.0707272 (097-4-07) «Свойства, обусловливающие персистенцию холерных вибрионов» и № 0120.1252079 (151-4-12) «Влияние стрессорных воздействий на свойства, обусловливающие персистенцию холерных вибрионов в организме человека и объектах окружающей среды».
Публикация результатов исследования. Материалы исследований отражены в 18 научных работах, 6 - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени, а также в патенте «Способ определения кадаверина при моделировании стрессовых ситуаций Vibrio choleraе О1 и О139 серогрупп» RU № 2566558 от 29.09.2015 г.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в том числе одной главы с описанием материалов и методов),
заключения и выводов, иллюстрирована 13 рисунками и 21 таблицами. Библиография содержит ссылки на 257 публикаций (в т.ч. 94 работы отечественных и 163 - зарубежных авторов).
Роль стрессового воздействия в адаптации и эволюции холерных вибрионов
Особое значение стресс имеет для микроорганизмов, живущих в изменяющейся окружающей среде, где происходят суточные и сезонные колебания температуры, рН, осмотического давления, отмечается недостаточное количество питательных веществ, в том числе дефицит азота, фосфора, железа и др.[141]. К таким микроорганизмам относятся и холерные вибрионы, поскольку характерной особенностью возбудителя холеры является чередование его пребывания в инфицированном макроорганизме с последующим существованием в природных экосистемах, что сопровождается появлением новых или модифицированных биологических свойств, которые облегчают адаптацию холерных вибрионов к измененным условиям существования и обусловливают эволюционные изменения на протяжении последних 50 лет [75,165].
Сведения о том, с какими именно стрессами окружающей среды сталкиваются холерные вибрионы, далеко не полны, но еще меньше известно, как они распознают эти стрессы и противостоят им [113,227]. При этом, где бы не находились вибрионы – в организме человека или окружающей среде – они используют одни и те же стратегии выживания: активацию общих и специфических реакций на стресс, в виде перехода в некультивируемое состояние-VBNC (viable but non culturable) [201,207,246] или так называемому «персистентному» фенотипу, выражающемуся в изменении морфологии клеток и метаболизма, экспрессии ряда белков, отсутствующих при выращивании микробов в оптимальных условиях, продукции экзополисахарида, что обеспечивает адаптивные преимущества клеткам [155]. В ответ на различные изменения окружающей среды популяция вибрионов реагирует изменением подвижности и хемотаксиса, адгезии, в частности, способностью переключаться с подвижного (планктонного) образа жизни на прикрепленный (биопленочный) и наоборот [106,222,249].
В этой связи особо важная функция принадлежит секреторным системам, «выравнивающим последствия эволюционного давления» с помощью различных регуляторных каскадов [150] в двух основных экологических нишах вибрионов – кишечнике человека и водной среде, тем самым поддерживая жизнеспособность микробов [135,154,232]. При определенных стрессовых условиях происходит модификация генов, ответственных за патогенность и персистенцию [34,168,183].
Сведения о том, с какими именно стрессами сталкиваются холерные вибрионы во время инфицирования, далеко не полны, однако наиболее распространены мнения, что при попадании в организм человека одними из наиболее часто встречающихся неблагоприятных факторов для холерных вибрионов являются кислая среда желудочного сока и воздействие желчи [105,169,179]. Показано, что V.cholerae, подвергаясь действию кислой среды, переходит в состояние стресса, для которого характерна толерантность к кислоте. Результатом стресса является транзиторная гиперинфекциозность – особое состояние возбудителя, в котором он покидает кишечный тракт человека [59,110,140]. Адаптированные к кислоте варианты активнее размножаются [98]. В условиях кислотного стресса было отмечено резкое подавление транскрипции мембранного белка OmpT, хотя экспрессия OmpU не менялась, что и обеспечивало толерантность вибрионов к кислоте [184].
Показано влияние жирных кислот и холестерина, присутствующих в желчи, на экспрессию факторов вирулентности и подвижность холерных вибрионов [112,113], повышение способности к формированию биопленки [166], а также снижение экспрессии холерного токсина путем подавления транскрипции генов ctxA и tcpA [99,137,202]. D. Provensano еt al. [205] считают, что формирование резистентности к желчи явилось одним из первых шагов в эволюции V.cholerae как кишечного патогена.
Недостаток кислорода в желудочно-кишечном тракте человека также является стрессовым фактором, влияющим на вирулентность холерных вибрионов. Z. Liu et al. [178] определили белки AphB, а позднее и OhrR, способствующие быстрой адаптации к анаэробным условиям холерных вибрионов путем облегчения активации транскрипции tcpP, способствуя тем самым успешной колонизации кишечника; снижение же OhrR связывает и регулирует промотор tcpP [178,247].
Кроме того, K. Marrero [181] считает, что анаэробиоз способствует синтезу факторов колонизации холерных вибрионов Эль Тор, предполагая, что это может играть значительную роль на ранних стадиях инфекционного процесса. Автором были определены 26 белков, участвующих в процессах приобретения железа, метаболизме аланина, синтезе пурина, энергетическом метаболизме и реакции на стресс, экспрессия которых изменяется в зависимости от содержания кислорода, а также белки, участвующие в синтезе экзополисахарида и образовании биопленки, и белки, необходимые для колонизации.
Рядом авторов высказывалось предположение, что в верхних отделах кишечника человека могут происходить события, связанные с горизонтальной передачей генов и формированием эпидемически значимых вариантов холерных вибрионов, т.е. ими рассматривалась роль желудочно-кишечных стрессоров в адаптации и эволюции холерных вибрионов [173].
Кроме того, в связи с выделением в последние годы генетически измененных штаммов холерных вибрионов, отличающихся гипервирулентностью и множественной антибиотикоустойчивостью [120,208,251], ведутся работы, связанные с поиском альтернативных методов воздействия на V.cholerae в макроорганизме при лечении холеры, которые также можно оценивать как стрессоры. Так, Z. Zhong et al. [256], S. Yamasak et al. [248], S. Chatterjee et al. [114,115] рассматривают влияние природных соединений, являющихся пищевыми ингредиентами (в частности, экстракта красного перца чили, капсаицина и спиртовой экстракции семян фенхеля) в качестве средств, значительно снижающих токсинопродукцию холерных вибрионов.
При миграции из организма человека в водную экосистему вибрион испытывает сложности в питании, воздействие необычной температуры и осмомолярности среды, вызывающие стресс, воздействие бактериофагов и лизис простейшими [130,182,237].
При недостатке питания (в голодных средах) холерные вибрионы не растут, но культивируются. В таком виде они могут находиться длительный срок – до 700 дней, что и описали М.Jubair et al. [155]. Авторы предложили термин "персистентный фенотип", чтобы отличать состояние голодающих клеток от некультивируемых. Рост таких клеток усиливается в присутствии фосфата и хитина, что подчеркивает их важность для выживания холерных вибрионов [206]. Y.Shibata et al. [219] в своих исследованиях, основываясь на работах по изучению V.vulnificus J. Nowakowska и J.D. Oliver [194], показавших, что в таком состоянии, полученном при воздействии низкой температуры и недостатка питательных веществ, бактерии более устойчивы к экологическим стрессам (высокая температура, этанол и антибиотики), чем обычные клетки. В работах D.E. Waturangi et al. [243], выделивших холерные вибрионы из коммерческих пищевых кубиков льда в Джакарте, и S.J. Krebs et al. [170], получивших кокковые формы холерных вибрионов в условиях недостатка питательных веществ, был показан более высокий персистентный потенциал холерных вибрионов, пребывающих в голодающем состоянии. Такие клетки оказались более устойчивы к замораживанию при -300С, содержанию хлора в концентрациях, превышающих нормы для водопроводной воды, к низким значениям рН, кислоте, чем обычные вибрионы и только воздействие желчи одинаково губительно сказалось на обоих вариантах клеток.
При воздействии низких температур (ниже 150С) у холерных вибрионов отмечается замедление роста [125], снижение экспрессии факторов вирулентности [234]. L.Townsley et al. [235] показали, что при низкотемпературном стрессе у холерных вибрионов активируются гены холодового шока cspV, cspA и, в меньшей степени, vc1142.
В работе С.П. Задновой с соавт. [35] при экстремальных температурах 40С и 420С отмечались разные показатели выживаемости у токсигенных штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, содержащих классический аллель гена ctxB и характеризующихся повышенной вирулентностью, и типичных штаммов данного биовара. При этом, у геновариантов, в отличие от типичных штаммов, при увеличении температуры увеличивается биосинтез белков OmpU и/или OmpT, а при снижении – экзополисахарида.
Токсинопродукция холерных вибрионов О1 серогруппы в условиях, имитирующих существование в окружающей водной среде
При изучении влияния низкотемпературного стресса на токсинопродукцию 15 типичных и генетически измененных штаммов холерных вибрионов в стерильной воде реки Дон (таблица 3) в течение 14 дней было отмечено увеличение показателей у большей части исследуемых штаммов по сравнению с исходными в 1,25-10,0 раз (за исключением штаммов 1601 и 17427 - у них наблюдалось незначительное снижение титра, и штаммов 569B, 1310, 19188, у них уровень продукции оставался без изменений). У двух штаммов вибрионов Эль Тор (типичного 5879 и геноварианта 19241) имело место резкое повышение продукции холерогена. Это, вероятно, связано с адаптивными регуляторными процессами, происходящими с холерными вибрионами при попадании из богатой питательной среды в новую экологическую нишу - речную воду, где они испытывают сложности в питании, действие необычной температуры и осмомолярности среды [58].
Через месяц стрессового низкотемпературного воздействия показатели токсинообразования резко снижались у большей части штаммов, вплоть до полного исчезновения признака к концу второго месяца. По истечении двух месяцев инкубации только три штамма V.cholerae El Tor сохранили способность к токсинопродукции: высокотоксигенный 1310, 3119 и 19667. Остальные 10 штаммов перестали продуцировать холероген, несмотря на рост культуры и сохранение генов ctxАВ.
Обращает на себя внимание, что реакция на стрессовое воздействие разных температур отличалась у типичных и генетически измененных вариантов. Так, средние показатели токсинопродукции при холодовом стрессе (40С) у геновариантов были выше только в первые две недели (рисунок 1), затем уровень холерогена у них снижался интенсивнее, чем у типичных штаммов (показания высокотоксигенного исходного мутантного штамма 1310 в расчет не принимались), т.е. они были более чувствительны к низким температурам, чем типичные.
Через три месяца низкотемпературного стресса ни одна их культур не выросла в среде AKI, показатели токсинопродукции были отрицательными, гены ctxАВ в ПЦР не определялись.
Было установлено, что, вне зависимости от отрицательных показателей токсинопродукции в ИФА, гены ctxАВ обнаруживаются в ПЦР до тех пор, пока в популяции исследуемых штаммов сохраняются живые вибрионы (показатели выживаемости даны в приложении). В «пустых» пробах, исследуемых после гибели всей популяции V.cholerae, гены, ответственные за токсинопродукцию, не обнаруживаются. Поэтому положительные результаты в ПЦР при проведении мониторинга за холерой, не сопровождающиеся выделением холерных вибрионов из воды, могут свидетельствовать об их наличии, но в очень низких концентрациях, требующих обогащения проб [58].
Таким образом, было показано, что низкая температура как стрессор, имитирующий условия окружающей среды в речной воде в холодное время года, вначале вызывает повышение токсинопродукции, но уже к концу первого месяца обусловливает резкое снижение продукции холерогена как у типичных, так и у генетически измененных штаммов.
При проведении опытов, моделирующих условия окружающей среды в теплое время года в водоемах Российской Федерации (22-240С) или в эндемичных очагах, при длительной инкубации (9 месяцев) наблюдалось сохранение токсинопродукци (таблица 4).
В течение первых 10-14 дней уровень ее значительно вырос (за исключением показателей высокотоксигенных штаммов 569В и 1310). При этом сохранение токсинопродукции у V.cholerae classical наблюдалось только на протяжении периода выделения (два месяца), к третьему месяцу они погибли, гены ctxАВ в среде не обнаруживались. При анализе данных, полученных при исследовании холерных вибрионов Эль Тор, было отмечено, что основная часть штаммов сохранила и даже несколько увеличила уровень токсинопродукции к исходу первого месяца. Наибольший интерес представляет штамм 18588, выделенный из воды реки Темерник, уровень токсинопродукции которого вырос с 0,31 до 10 мкг/мл и оставался таким практически до конца пятого месяца исследования.
К окончанию второго месяца культивирования при 220С в речной воде у 2 штаммов (19613 и 19667) отмечалось увеличение уровня продукции холерогена до 2,5 мкг/мл, у 2 - некоторое снижение (5879 и 17427). Дальнейшие исследования на протяжении 3-9 месяцев показали постепенное снижение токсинопродукции практически у всех изучаемых штаммов, но к концу исследования она, тем не менее, оставалась выше, чем у исходных штаммов в 2-10 раз.
Обращает на себя внимание, что в отсутствие выраженного температурного стресса (220С) токсинопродукция у генетически измененных вариантов вибрионов Эль Тор на всем протяжении исследования были в 2-8 раз выше, чем у типичных штаммов, что в полной мере характеризует их, как варианты с повышенной вирулентностью (рисунок 2).
Таким образом, было показано, что токсигенные холерные вибрионы могут выживать в стерильной речной воде при температуре 220С-240С достаточно продолжительный срок с сохранением продукции холерного токсина, т.е. оставаясь эпидемически значимыми. Не исключено, что в условиях методически очень сложного длительного эксперимента с необеззараженной речной водой, содержащей органические и неорганические загрязнения, зоо- и фитопланктон, бактериофаги, большое количество конкурирующей микрофлоры, сроки персистенции могут меняться.
Наибольший интерес в этой серии опытов представляло моделирование условий пребывания холерных вибрионов в речной воде в летнее, осеннее, зимнее время при разных температурах (два месяца при 220С–1,2 месяц; затем пробы переносились на два месяца при 100С–3,4 месяц от начала инкубации; а затем на четыре месяца при 40С - 5,6,7 месяц). Результаты представлены в таблице 5.
Классические холерные вибрионы 569В в течение первого месяца инкубации при 100С снизили уровень токсинопродукции, а еще через месяц при этой температуре не высевались и токсин не продуцировали. Гены ctxАВ отсутствовали.
Второй классический штамм 1601 при 100С не рос, токсин, соответственно, не продуцировал, гены ctxАВ в ПЦР не определялись.
Токсигенные холерные вибрионы Эль Тор переживали снижение температуры до 100С в течение первого месяца с сохранением незначительной части популяции (показатели выживаемости даны в приложении), у 9 из 13 штаммов наблюдалось снижение количества токсина, что, вероятно, связано с отсутствием необходимости продукции этого белка в речной воде в больших количествах и энергетически невыгодно вибрионам. В течение второго месяца инкубации уровень холерогена у выжившей части популяции штаммов сохранился практически без изменений. Вибрионы штаммов 1310, 3119, 19241, 18826, 17427 на данном сроке в посевах не обнаруживались, гены ctxАВ в ПЦР не определялись. При дальнейшем снижении температуры до 40С вибрионы в пробах не обнаруживались, гены ctxАВ в ПЦР не определялись. Обращает на себя внимание, что на протяжении 4 летне-осенних месяцев при 220С и 100С у генетически измененных вариантов токсинопродукция в среднем была в 2-4 раза выше (рисунок 3), что необходимо учитывать при проведении эпиднадзора за холерой. инкубации типичных и генетически измененных холерных вибрионов в речной воде при постепенной смене температур.
Влияние температурного стресса на образование биопленок в опытах, моделирующих условия персистирования холерных вибрионов в речной воде
С учетом эпидемиологической значимости выяснения закономерностей персистенции холерных вибрионов различной эпидемической значимости в воде открытых водоемов были проведены длительные (девять месяцев) исследования по оценке влияния температурных стрессовых условий на процесс биопленкообразования и выживания. Для экспериментов использовали воду реки Дон и варьировали температуру от 40С до 220С.
В предварительной серии опытов была дана сравнительная оценка способности к биопленкообразованию при культивировании при 220С в речной воде и в среде М9 в сроки от 7 до 30 суток. Результаты приведены в таблицах13,14.
Отмечено, что после 30 суток культивирования у большинства штаммов показатели ОП как в речной воде, так и в среде М9 были ниже, чем после 7 суток, т.е. наблюдалась тенденция к дисперсии биопленок. Исключение составили четыре нетоксигенных штамма Эль Тор вибрионов, у которых в речной воде показатели через месяц были выше, чем через 7 дней.
При этом у токсигенных холерных вибрионов (ctx+tcp+) через 7 и 30 суток культивирования показатели биопленкообразования были выше в среде М9, чем в речной воде в 1,7 и 2,6 раза, соответственно. У классических холерных вибрионов (несмотря на низкие значения ОП) наблюдалась та же картина. У нетоксигенных вариантов, напротив, показатели были выше в речной воде, чем в среде М9: у сtxcp+ в 3,2 раза (как после 7, так и после 30 суток культивирования); у ctxcp- в 3,2 и 5,1 раза, соответственно. Таким образом, было показано, что даже в отсутствии выраженных стрессовых воздействий способность к биопленкообразованию при персистировании в различных экологических нишах зависит от эпидемической значимости V.cholerae О1.
В серии пролонгированных опытов (9 месяцев), проводимых с использованием речной воды, установлено, что классические холерные вибрионы в речной воде отмирали в течение первых месяцев даже при температуре 220С и биопленки не формировали, токсигенные (ctx+tcp+) вибрионы Эль Тор при 220С на протяжении всего срока исследования формировали «слабые» биопленки, а при 40С к 3 месяцу исследования показания ОП были нулевыми (см.приложение таблица 1), рисунок 7.
При этом было установлено, что выжившие планктонные клетки при этой температуре через 2 месяца составляли всего десятые доли процента (см. приложение таблица 2), рисунок 8.
Показано, что при 40С холерные вибрионы через 2-3 месяца формировали, наряду с типичными колониями, «ругозные» варианты, которые постепенно отмирали в стрессовых условиях (рисунок 9).
У нетоксигенных ctxcp- вибрионов, напротив, большая часть популяции сохранялась при 40С (показатели биопленкообразования были выше, чем при 220С) на протяжении всего срока исследования. То же касается и выживаемости планктонной части популяции - она была несколько выше в холодной воде (5% против 1,5% - см. приложение). Это может свидетельствовать о способности таких вибрионов длительно персистировать в окружающей среде как в теплое, так в холодное время года за счет большей приспособляемости к выживанию в водных экосистемах. Холерные вибрионы, у которых отсутствовали гены токсинопродукции, но имелись гены tcp, сохранялись на протяжении всего срока исследования при обеих температурах, но продукция ЭПС была гораздо выше при 220С. В процессе культивирования при 40С уровень биопленкообразования этих штаммов несколько увеличивался к 4 месяцу, а затем существенно снижался. У вибрионов этой группы к концу 9 месяца при 220С выживало 10% популяции клеток (наиболее высокий показатель среды всех изучаемых вибрионов), при 40С – всего 0,7% (но это значение всего в 7 раз ниже, чем у нетоксигенных ctxcp- штаммов). Это свидетельствует о достаточно высоком адаптогенном потенциале ctxcp+ вариантов.
Токсигенные холерные вибрионы Эль Тор при постепенном снижении температуры выживали только при температурах 220С и 100С (при этом к концу 4 месяца высевалось лишь 0,0009% клеток), при 40С живых клеток обнаружено не было. Снижение количества живых вибрионов речной воде коррелировало со снижением показателей биопленкообразования (коэффициент корреляции - 0,9).
Классические холерные вибрионы (как и в предыдущем эксперименте) практически отмирали уже на протяжении первых месяцев исследования при 220С и не формировали биопленки.
Нетоксигенные штаммы сохранялись на протяжении всего эксперимента, хотя количество клеток к концу исследования было невелико (0,8% от исходного показателя). Что же касается биопленок, то их значения в этой группе штаммов к концу исследования при 40С были выше, чем в начале эксперимента, вероятно в результате адаптации к стрессовым условиям обитания. Высоко устойчивыми к стрессовым факторам оказались штаммы c генотипом ctxcp+, лишенные генов токсинообразования, но способными их приобрести при определенных условиях за счет токсинкорегулируемых пилей адгезии. Эти вибрионы выживали на протяжении всего срока исследования (хотя к концу эксперимента сохранилось всего 0,3% планктонных клеток). На протяжении 7 месяцев персистирования в воде при разных температурах эти штаммы формировали самые выраженные биопленки (показатели ОП – самые высокие).
Таким образом, можно констатировать, что эпидемически значимые токсигенные холерные вибрионы даже в условиях стерильной речной воды достаточно быстро (в течение 2-3 месяцев) погибают, гибель идет тем быстрее, чем ниже температура. Показатели выживания коррелируют с показателями биопленкообразования. Нетоксигенные (ctхcp+ и ctxcp-) вибрионы выживают в речной воде и сохраняют биопленки достаточно продолжительное время, что может свидетельствовать об их выраженном антистрессовом и персистентном потенциале.
Изучение влияния стрессоров, имитирующих эндогенные факторы желудочно-кишечного тракта на антилизоцимную активность холерных вибрионов
В качестве монострессоров, оказывающих влияние на холерные вибрионы в организме человека, были использованы кислота, желчь, низкий и высокий рН, микроаэрофильные условия, комбинированный стресс. Эксперименты повторяли трехкратно, максимальное отклонение значений составило ±1 мкг/мл. Результаты опытов представлены на рисунке 13.
Полученные результаты по влиянию различных стрессоров на антилизоцимную активность в организме человека показывают, что холерные вибрионы в зависимости от эпидемической значимости и источника выделения по-разному реагируют на факторы, воздействующие на них. Так, холерные вибрионы классического биовара и эпидемически значимые вибрионы биовара Эль Тор практически не реагировали на стрессовые воздействия (уровень АЛА оставался 2-3 мкг/мл).
В группах нетоксигенных холерных вибрионов (ctxcp+ и ctxcp-) средние показатели АЛА под воздействием щелочи, желчи и комбинированного воздействия резко снизились (с 9,8 и 11,75 мкг/мл в контроле до 3,6-4,0 и 2-4,5 мкг/мл, соответственно, в опыте). Наиболее сильное воздействие оказывал комбинированный стресс.
Таким образом, даже на небольшом количестве штаммов показано, что холерные вибрионы Эль Тор обладают способностью к фенотипической его вариабельности в зависимости от температурных и других условий обитания холерных вибрионов. По результатам влияния комбинированного стресса наиболее «стойкими» оказались токсигенные ctx+tcp+ варианты (снижение АЛА всего на 19%), у атоксигенных (ctxcp+ и ctccp-), соответственно, на 63,3% и 83,0%, что косвенно свидетельствует о роли этого «малого признака персистенции» в патогенезе холеры.