Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время внимание многих исследователей напр%лено на создание эффективных вакцинных препаратов против менингококка серогрушш В,так как проблема борьбы с менинго-кокковой инфекцией указанной серогруппы-одна из актуальных задач здравоохранения.
Эндотоксин менингококка интересен как кандидат будущей вакцины и как антиген для разработки диагностических препаратов Дувакина В.И. с соавт. 1989 /.ЛПС N- meningltidia обладает широким спектром биологических и иммунологических свойств.Согласно литературным данным/Петров А.Б. с соавт.1990, Jennings H.J. с соавт. 1983, тваі с.-М. с соавт.1934/ЛПС менингококка имеет двойственный характер.С одной стороны он является протективным антигеном,так как антитела к ЛПС быстро опсонизируют клетку,активируют систему комплемента и вызывают фагоцитоз /Дмитриев Б.А. с соавт. 1990 /.С другой стороны менингококковый эндотоксин обладает высокой токсичностью и пирогенностью.Протективные свойства ЛПС ис- * пользуются исследователями для создания вакцины на- основе данного антигена.Но наряду с созданием эффективной вакцины,перед учеными встает задача обнаружения менингококкового эндотоксина в вакцинных препаратах,как нежелательной примеси.
Для разработки менинтококковых вакцинных препаратов на основе ЛПС-антигена необходимо глубокое изучение его количественных и качественных характеристик.Одним из аспектов этого изучения является определение свойств ЛПС при изменяющихся условиях культивирования. Ученым удалось выявить влияние аэрации,определяемой числом оборотов шейкера.фазы роста,состава питательной среды на выход препарата менингококкового ЛПС и его физико-химическую характеристику / угаасЬ СЕ. с соавт.1976, p00lraan J.T. о соавт.1985, Jennings H.JO соавт.1983,Tsal с—M-c соавт.1986/. Также имеются отдельные сообщения,'в которых авторам удалось обнаружить как r -форму менингококкового ЛПС,так и 3 -форму ЛПС /Apicella М.А. 1979, Perry М.В. с соавт.1975, Гагг T.R. с соавт. 1984/.
Общим недостатком этих исследований является использование неуправляемого периодического процесса культивирования на плотной и в жидкой питательных средах,содержащих природные компоненты,либо в синтетических средах,состоящих из большого набора дорогостоящих
-2- соединений.Такие методические подходи не позволяют объективно и достоверно изучить влияние условий культивирования на свойства" менингококкового ЛПС.В используемых авторами процессах периодического культивирования,как известно .происходят постоянные изменения как состава культуральной среды,так и свойств микробных клеток, что приводит к невосприэводимости результатов,Применение питательных сред .содержащих природные компоненты,или синтетических сред с большим набором соединений предусматривает наложение на получаемые результаты дополнительных эффектов,не связанных с исследуемым препаратом ЛПС.
В лаборатории моделирования процессов культивирования микроорганизмов НИИВиС им.И.И.Мечникова разработаны и изучены управляемые процессы культивирования Neisseria meningitidis . в синтетической питательной среде,состоящей из небольшого количества доступных компонентов/Лопырев И.В. 1984;Карабак В.И. с соавт.1985,1986; Баснакьян И.А. 1989/.Однако такие исследования не были направлены на изучение менингококкового ЛПС.
Целью работы было изучение влияния условий управляемого культивирования neisseria- meningitidiajeporpynnH В на выход,химический состав и физико-химическую характеристику,биологические и серологические свойства менингококкового ЛПС.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи; І.Из N. meningitidis .выращенного в условиях многоциклическо-. го,сливно-доливного,непрерывного управляемого процессов культи-. вирования,выделить препараты ЛПС с помощью метода westphel о. и Jann К. . 2.Изучить влияние фазы роста,содержания в среде кислорода и глюкозы, типа процесса культивирования на выход и химический состав менингококкового ЛПС. 3.Изучить физико-химическую характеристику получаемого менингококкового ЛПС. 4.Определить условия культивирования,позволяющие обнаружить высоко-
-молекулярную форму ЛПС. 5.Изучить биологические и серологические свойства препаратов ЛПС, имеющих отличную друг от друга физико-химическую характеристику. 6.Подобрать методы количественной и качественной оценки присутствия менингококкового ЛПС в менингококковой полисахаридно-белко-вой вакцине. Научной новизной выполненной работы явилось установление влияния
-3-условий культивирования на выход и физико-химические свойства менингококкового ЛПС.
Обнаружен разный выход ЛПС при изучении штаммов менингококка серогрупп А,В,С,а также у разных штаммов одной и той же серогруп-пы В.
Показано,что влияние фазы роста на выход ЛПС,полученного из клеток IT. meningitidis штамма №125,проявляется в условиях избытка кислорода-в экспоненциальной фазе роста выход препарата наибольший.
Установлено влияние растворенного в среде кислорода и глюкозы на выход препарата ЛПС:выход ЛПС больше при лимите кислорода,чем при его избытке;при содержании в среде кислорода на уровне 0% от полного насыщения выход ЛПС возрастает с увеличением содержания глюкозы в питательной среде.
Определены условия культивирования N. meningitidla .позволяющие микробным клеткам синтезировать низко-молекулярную форму ЛПС /4-7 кД/;условия,обеспечивающие синтез болев высоко-молекулярной формы ЛПС /10-15 кД/;а также совокупность условий,способствующие синтезу высоко-молекулярной формы ЛПС/20-40 кД/.
Обнаружено влияние степени чистоты и молекулярной массы ЛПС на его токсичность и величину константы связывания антигена/АГ/ о антителом/AT/ в иммуноферментном анализе /ИФА/:с увеличением молекулярной массы ЛПС значение константы связывания увеличивается на порядок.
Практическое значение выполненной работы;
Отработаны три модификации метода выделения и очистки ЛПС по ffeetphal о. и Jann к. .направленные на повышение выхода ЛПС из культуры /1-я модификация/,получение более очищенного препарата ЛПС/2-я модификация/,повышение выхода очищенного препарата ЛПС /3-я модификация/.
Установлено,что сливно-доливной процесс культивирования ппи поддержании кислорода на уровне 20$ от полного насыщения и непрерывный процесс культивирования менингококка обеспечивают получение препаратов ЛПС,минимально загрязненных примесями.
Положение.выносимое на защиту; Зависимость выхода,химического состава и физико-химической характеристики препаратов ЛПС от фазы роста культурыц. meningitidlB, уровня растворенного кислорода,содержания глюкозы в питательной среде и типа процесса культивирования.
Апробация работы. Диссертация апробирована на научной конференции отдела условно-патогенных микроорганизмов НИИВиС им.И.И.Мечнвд ва Российской АМН 18.02.1992 г.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 работы /список щ веден в конце реферата/.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения,2 глаг обзора литературы,4 глав собственных исследований,заключения,выводов и списка цитируемой литературы.Работа изложена на ^6^ стр. машинописного текста,иллюстрирована 2>Ч рисунками и -IS таблицами.В работе использовано 6^ отечественных и (0$ иностранных источников.