Введение к работе
Актуальность дроблены. Успешная борьба с мвнивтококковоЯ нфекцпей тесно связана с усовершенствованием ее лабораторной иагяостлки, что поззоляет быстро, на высоком методологическом ровне проводить выделение а идентификацию возбудителя заболе-акия. Определение групповой принадлежности выделяемых штаммов пособствузт установлению эпидемиологической значимости дозо'у-ателя и обусловливает тактику в проведения-проійвозлидешче-
:'ДХ КйрОПрЯЯТЙЙ.
Ведувдм методом серогруппироваяия менингококков остается їакция агглютинации на стекле, с использованием коммерческих ;аангококкозых агглютанирущих сывороток серогрупп а.,в, С D,
, Ї, Z, W-135, 29Е. .. ..*....
Качеству этих препаратов - ах специфичности, уровню активісти, способности выязлять в штаммах минимальное количество ецифического антигена - придается большое значение.-
Агглютинирующие сыворотки - основной компонент раанообраз-х иммунологических реакций и от их качества во многом зависит спроизводигасть и кадеаяость полученных результатов. Несмотря это, стандартные образцы, а такке научно обоснованные подхо-к созданию таких препаратов до настоящего врешки не разра-ганы. В то время как опыт работы контролирующих организаций называет, что создание и применение стандартных образцов раз-с уровней: международных, национальных, стандартных образцов іДприятиЯ, позволяет проводить не только сравнительное изуче-: определенных параметров диагностических препаратов, но а :рызает дополнительные пути унификации и улучшения качества с.юрческой продукции.
_ 4 -
Развитие лабораторной диагностики невозмзано без изучения биологических свойств возбудителя. В сообщениях'ряда авторов (Андреева З.М. и соазт., 1975;,Трушш:оза А.Г., 1985; Баснакьян И.А., 1989, 1990) ; называется, что существенное влияние на.достоверность результатов серогруппирования оказывает вариабельность антигенного состава кенингокохковых.культур. Вааное значение тлеет качество и оптимально сть питательных сред, условия культивирования, стабильность культур при пересевах'и длительных сроках хранения. Шталаш, вццеленяке из спинномозговой гад-кости и крови в период острого течения заболевания, как правило, йлкэт полноценный набор специфических антигенов и определение серогруппы с помощью агглютияируацих сывороток в реакции агглютинации на стекле не вызывает затруднений. Среди культур, выделенных при других формах менингококковой инфекцяии от бактерионосителей, обнаруживают от 15 % до 50 % полиагглютияабельнш: или инагглютияабельяых штаммов. В этом случае необходимо привлечение более чувствительных методов и высокоактивных' диагностических препаратов.
Нестабильность антигенных свойств.менингококков создает определенные трудности внутривидовой идентификации возбудителя. Для решения проблем целесообразно привлечение новых критериев, основанных на достижениях, связанных с изучением антигенов белковой природы. В последние годы нашли широкое применение методы электрофоретического анализа протеиаограш различных белков клетки. Так по рисунку спектра внеклеточных белков значительно различаются бактерии, относящиеся к различным-родам, видам и даке биотипам (Дегтева Т.К. и соавт., 1990; Болчкевич Т.А. и соавт., Ї99І; Eutenener В., loose M.I985). Однако исследований, направленных на изучение внеклеточных белков с целью использования их
« идентисгкацли менингококков, согласно литературным данным,
ПроВОДИЛОСЬ.
Цель работы
-
Стандартизация качества менингококкозых агглютинирующих вороток серогрупп А, В, С путем создания первых серий рефереяс-агентоз.
-
Разработка нового метода идентификации мекингококковых ль тур, находящихся на разных стадиях диссоциации.
Для достижения поставленной цели были определены следующие дачи:
1. Провести анализ качества производственных серий мзнинго-
кковкх агглютинирующих сывороток серогрупп А, В, С, вкпускае-
х НИИ вакцин и сывороток г, Санкт-Петербурга і подтвердить стильность утвержденных в ЩД методов контроля.
-
Разработать критерии оценки сывороток, отвечающих требони ям, предъявляемым к стандартный образцам.
-
Подтвердить рациональность методов направленного отбора , применяемых при контроле менингококховых агглютинврую-к сывороток.
-
Научно обосновать и экспериментально доказать пригод-сть применения метода электрофореза в полиакраламкдном геле а изучения внеклеточных белков менингококков.
Научная новизна работы
Впервые разработан "Способ внутривидовой идентификации кингококков на основе внеклеточных белков" с использованием года электрофореза в поддакриламидном геле. Способ зацищен горским свидетельством & 1693061.
Впервые получены первые серии стандартных образцов сыворо-< манонгококковых агглютанируюцих серогрупп А, В, С согласно
общим требованиям, предъявляемым ВОЗ к ресаеренс-реагентам, и требованиям, разработанным в ГйСК им. Д.А.Тарзсевича„
Обосдаванн методы отбора штаммов,-используемых для контроля качества коммерческих «.йнингококковых агглютинирующих сивороток.
Практическая значимость
Подготовлены а'утверждены Свидетельства и Инструкции по пршлэнешш стандартных образцов сквороток менингококковых агглютинирующих серогруда А, В, С» Показана .возмоаноста использована» указанных сьшороток при контроле качества различных антигенных и антителъкых диагностических препаратов.
Разработан сертификат качества .сывороток менингококковых агглютинирующих серогрупп Д,В С.
Ыат&рЕалн внутривидового группирования менингококков по протеинограммам внеклеточных белков вошш в утвержденные Кома- тетом санитарно-эпидемиологического надзора 23 карта 1993 г. методические рекомендации "Злзктрофоретичёские метода дифференциаций возбудителей .гнойно-воспалительных заболеваний", разработанные совместно с НИИ эпидемиологии и микробиологии г. Нижний Новгороде
Предложен набор штамдав кавдо! серогруппы менингококков (в качестве контрольных) для проведения сравнительного анализа при изучений электрофореграмм внеклеточных белков.
Апробация работы. Результаты работы доложены- и обсуядены на заседаниях Ученого Совета и научных конференциях ИСК им. I „АЛарасевача (1986, 1987, 1992), на проблемной конференции в г„ Перш (1988)с на научно-практическом семинаре в НИИЭМ ' г. Нижний Новгород (1993).
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.
Объем в структура диссертации. Диссертационная работа сото ит из введения, семи глав, заключения, выводов, общим объе-ом ЗД^зтраниц машинописи. 'Работа иллюстрирована 20та,;5ли~ аїли и: т л рисунками в тексте. Библиография состоит из 95 те-ественных и JQ3 зарубежных названий литературных источников.
Материалы и методы
В работе использованы эталонные и свежевкделенные штаммы ЄЕИНГОКОККОВ серогрупп А, В, С, D, X, Г, Z, W-135* 29Е. 5 серотиповых штаммов" группы 3, а также 45 штамшв непатоген-ых видов нейссернй, хранящиеся в коллекціш микроорганизмов ИСК им. Л.А.Тарасевича. Для создания адекватных условий при остановке экспериментов использовали набор штатов одного вре-ени сушки, применяли одияакозые способы культивирования микро-рганизмов. При оценке качества производственных серий меяингс— окковых агглютинирующих сывороток^ разработке отраслевых стая-артных образцов (рефереяс-реагентов) был использован 61 вдузей-ый шташ. Для подтверждения выявленных закономерностей при равнительном изучении Слектрофореграмм белковых антигенов менин-ококка изучался набор из 116 музейных штаммов, с определенной ерологической принадлежностью, а также 25 доли- и -инагглюти-абельных штаммов, полученных из Центрального кожно-венерологи-вского института.
Изучено и охарактеризовано по специфичности и активности 7 серий агглютинирующих шнингококковых сывороток серогруппы А, 3 - серогруппы В, 30 - серогруппы С. Для проведения экслеримэн-альных исследований использовано 12 серий сывороток серогрупп , х, y, z, w-135. 29Е производства НКИВС г. Санкт-Петербурга,
- 8 -10 серий прецапитирущих сывороток серогругш А, С, D, X, Y, Z, й-155 t 29Е , выпускаемых Ставропольским НПО "Биошд", 6 серий мешшгококкового зритроцитаркого диагно стику ш, изготовленных на производственном предприятии НКИЭМ ем. Г.Н.І^бричевского
Подготовлены и изучены 5 серий мениктококковых агглютинирующих сывороток серогрудп А, В, С, кандидатов в отраслевой стандартный образец.
Специфичность и активность диагностических сывороток изучали с дошщью реакции агглютинации на стекле, ищунодрецЕпитациа в геле по Оухтерлони, развернутой реакции агглютинации по Ноблю я ВИЭФ (Никитин В.М., 1982).
Для электрофоре тического разделения растворимых внеклеточных белков использовали методг предложенный DeviS В. и Огп-stein м„ (1964) в модификации Молодовской Э.В., Дегтевой Г.К. (1969). Количественное содержание белка в препаратах определяли стандартным методом Lowry О. . Степень сходства лротеинограмм оценивали по методу Дегтевой Г.К., Блохиной И.Н. (1972) на основе вычисления коэффициентов подобия электрофореграмм с учетом общих белковых фракций.
Статистическую обработку материалов проводили согласно общепринятым методикам (Ашарин И.П., Воробьев А.А., 1962).