Введение к работе
Актуальность проблемы.
В течение последних десятилетий существует устойчивый интерес к микробным сообществам гидротерм. Этот интерес обусловлен принципиальным значением микробной жизни в гидротермах как собственно для микробиологии, так и для других областей естествознания.
Биоценозы гидротерм представляют собой уникальные сообщества живых существ. Развиваясь при высоких температурах (от 40-45С до точки кипения), они образуются в основном прокариотами - термофильными эу- и архебактериями. Подавляющее большинство микроорганизмов, входящих в состав микробных сообществ гидротерм, не встречается в других местообитаниях. Таким образом, гидротермы являются богатейшим источником для выделения новых таксонов бактерий со специфическими физиолого-биохимическими свойствами, часто биотехнологически ценными.
Микробные сообщества гидротерм относят к наиболее древним биоценозам Земли; их изучение играет важную роль в формировании представлений об эволюции биосферы.
Особенностью биогеохимических циклов, функционирующих в гидротермах, является постоянное вовлечение в них продуктов вулканической активности. В частности, для термальных местообитаний характерна значительная роль цикла серы, соединения которой, имеющие исходно вулканическое происхождение, участвуют затем в цепи реакций, в том числе и осуществляемых микроорганизмами.
Элементная сера является одной из наиболее количественно значимых форм серы в гидротермах. Способность микроорганизмов к восстановлению элементной серы в сероводород известна давно; данные последних лет указывают на большое значение этого процесса именно для термофильных микроорганизмов, обитающих в гидротермах. Однако биогеохимическая роль процесса бактериальной сероредукции в гидротермах не определена.
Восстановление элементной серы может осуществляться литоавто-трофными микроорганизмами в процессе продукции органического вещества; этот же процесс может слукить терминальной восстановительной реакцией при его анаэробной деструкции. Среди подобных реакций наиболее значимыми с точки зрения биогеохимии считаются сульфатредук-
ция и метаногенез. Вклад бактериальной сероредукции в процесс де струкции органического вещества в большинстве экосистем, как прави ло, не учитывается; конкретные механизмы участия сероредуцирующи: бактерий в анаэробном цикле углерода не исследованы.
Таким образом, помимо специального интереса к микробным сооб ществам гидротерм как к уникальным биоценозам, они могут являться і удобным объектом для исследования нового терминального процесс; анаэробной деструкции - бактериальной сероредукции.
Состояние вопроса.
Способность микроорганизмов осуществлять восстановление элементной серы в сероводород в процессе анаэробного роста была впервые продемонстрирована Пельшем на примере водород-использугащих се-роредуцирующих организмов - "Hydrogenthlobacterla" (Пельш, 1936). 1 настоящее время показано, что эта реакция широко распространен) среди микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим і физиологическим группам, и выполняет разнообразные функции в их метаболизме - от побочной реакции до ключевого катаболического процесса (Ъе Paou et al., 1991; Sohauder, Kroger, 1993). Группа обЛИ-гатных сероредуцирувдих бактерий относительно невелика и таксономи-чески разнородна. Первым таким организмом, долгое время остававшимся единственным представителем этой группы, была мезофильная эубак-терия Desulfuromonas acetoxldana (Pfennig, Biebl, 1976); ее основным энергетическим субстратом является ацетат. Диссимиляционяая се-роредукция, или серное дыхание, свойственна также некоторым факультативным или облигатным анаэробам как один из альтернативных способов получения энергии (Widdel, Hansen, 1991). К моменту начала нашей работы в 1982 г. среда субстратов мезофильных бактерий с сернш дыханием были известны ацетат, молекулярный водород, формиат, лактат, что определяло их экологическую роль как участников терминального этапа анаэробной деструкции органического вещества - анаэробного окисления продуктов брожения. Вместе с тем роль сероредукции I процессе анаэробной деструкции органического вещества либо не рассматривалась, . либо считалась пренебрежимо малой (Lovley, Klug, 1986). В последующие годы появились данные, указывающие на значимость процесса бактериального восстановления элементной серы в эв-трофицированных морских и пресноводных осадках (Кучинскене, 1988,
Михеев и др., 1990, Горленко и др., 1990); недавно опубликованные данные расширили спектр субстратов, окисляемых в процессе серного дыхания, который включает теперь ряд летучих жирных кислот- (Plnster, Bak, 1993). Вместе с тем роль сероредуциругацих бактерий в мезофиль-ных анаэробных сообществах пока не охарактеризована.
Интерес к бактериальному восстановлению элементной серы получил мощный стимул в процессе исследования микробных сообществ гидротерм. Исследование термальных местообитаний, начатое в 60-е годы работами Брока в Иеллоустонском национальном парке ..(Brook, .1978), привело к открытию большого числа новых термофильных организмов, часто с высоким биотехнологическим потенциалом, что в свою очередь дало толчок к поиску новых термофильных бактерий. Совпав по времени с пиком интереса к анаэробным микроорганизмам и процессам, исследование термальных местообитаний в 1970-80-е годы привело к описанию ряда новых таксонов облигатно анаэробных бактерий. Из Иеллоустон-ского национального парка были выделены умеренно термофильные орга-нотрофы, метаногены, сульфатредукторы (Zeikus et al., 1979; Zeikus et al., 1980; Zeikus et al., 1983).
Немаловажную роль в привлечении внимания к микробным сообществам гидротерм сыграло сенсационное сообщение Дж. Барроса (Ваговз, Demlng, 1983), впоследствии не подтвердившееся: о микробиологических процессах в глубоководных гддротермах ("черных курильщиках"), протекающих при температуре 2500.
Микробные сообщества наземных гидротерм исследовались в основном на примере цианобактериалъных матов, развивающихся при температуре 40-65С. Было показано, что сульфатредукция и метаногенез являются основными процессами анаэробной деструкции органического вещества цианобактерий; важную роль в процессе утилизации продуктов брожения играет также фотоассимиляция их Ghloroflexua аигапНасиз -одним из основных фототрофных компонентов мата (Ward et al., 1984, Ward et al., 1989).
В России исследования микробных процессов, протекающих в вулканических местообитаниях были начаты еще работами СИ. Кузнецова по гидротермам Камчатки (1955), продолжены Заварзиным, Ивановым, Каравайко (Заварзин, Жилина, 1964, Иванов, Каравайко, 1966; Завар-зин и др., 1967, Ivanov.et al., 1968). Связанные по большей части с исследованием окислительных микробиологических процессов в гидро-
термах, эти работы указывали на особое значение цикла серы для тер мальных биотопов. В более поздних работах Герасименко и Орлеанског по цйзкобактериальным матам кальдеры Узон был исследован видово состав цианобактерий, охарактеризованы процессы газового обмена литификации (Герасименко и.др., 1989). Полученные данные послужил основой для обоснования гипотезы о вкладе цианобактериальных сооб ществ докембрия в формирование современной атмосферы Земли (Завар зин, 1984). Одновременно было начато исследование метанобразущи бактерий, входящих в состав термофильных цианобактериальных мато (Кожевникова, Ягодина, 1982, Жилина и др., 1986).
Элементная сера является одной из наиболее распространенны форм серы в термальных местообитаниях. Ее участие в метаболизм термофильных бактерий, обитающих в гидротермах, было вначале уста новлено для аэробных бактерий, окисляющих серу. Из гидротерм Итали и йеллоустонского национального парка был выделен Sulfolobua асісіо саібагіиз (Brook et al., 1967) - тврмоацидофильный организм, разви веющийся при температуре 70-750 и рН 2-4 за счет окисления. s д сульфата.
Вместе с метаногенами и экстремальными галофилами термоацидо филы получили название архебактерий, представляющих собой независ» мую филогенетическую ветвь (Woese, Fox, 1977; Woese et al., 1978 ! др.). Основанное на нуклеотидяых последовательностях рибосомальны: FHK, это деление потвервдается другими общими признаками: отсутствием даптидогликановой клеточной стенки, наличием бифитаниловы: эфиров в составе липидов, особенностями структуры FHK-полимеразы специфическими путями метаболизма, и, главное, обитанием в экстремальных условиях (Kandler, 1993). Архебактерий отнесены к домен: Archoea, подразделяющемуся на два царства: Crenarchaeota и Вигуаг-chaeota (Woese et al., 1990).
В Crenarchaeota вошли исключительно экстремально термофильны* серозависимые архебактерий, подразделенные на 3 порядка: Thermopro-teates, Ругodicttales и Sulfolobalea.
Два первых порядка целиком состоят из облигатно анаэробных экстремально термофильных архебактерий, восстанавливающих алементнуї серу. Первый представитель этой группы - Thermoproteua tenax - 6hj выделен Циллигом и Штеттером из накопительных культур Sul/olobtu (Zillig et al., 1982). Этими же исследователями в последующие годі
были выделены еще 10 родов экстремально термофильных серовосстана-вливащих архебактерий: Deaulfurococcua, Thermofllvm, Staphylother-тлз и Pyrooaculvm, отнрсящиеся, как и род Thermoproteu3, к порядку Thermoproteales; Pyrodictium, Hyperthermia и Thermodiacua, входящие в порядок Pyrodlctialea, а также Thermococcua и Ругососсиз, представляющие порядок Thermococcalea, отнесенный к царству Euryarchae-ota. Все эти организмы развиваются в интервале температур 80-П0С; так называемые "гипертермофилы" имеют температурный оптимум развития выше Ю0С. По типу метаболизма они могут быть разделены на 3 группы:
а) облигатные литотрофы, использующие молекулярный водород -
Pyrodictivm ocoultvm, Pyrodictivm brockii (stetter et al., 1983) и
Thermoproteus neutrophil's (Fisher et al., 1983);
б) организмы, способные как к литотрофному росту с использова
нием водорода, так и к органотрофному за счет окисления пептвдов и
полисахаридов в процессе серного дыхания - T.tenax, Pyrooaculvm
tslandicum (Huber et al., 1988);
в) облигатные органотрофы, растущие только за счет использова
ния сложных органических субстратов - p. deaulfvrococcua (Zillig et
al., 1982), Thermococcua (Zillig et al., 1983), Ругососсиз (Mala,
Stetter, 1986), Staphylothermoa (Mala et al., 1986), Hyperthermia
(Zillig et al., 1991), а также Pyrooaculvm organotrophvm (Huber et
al., 1988) и Pyrodictium аЬуззі (Pley et al., 1991).
Представители первых двух групп, а также P. organotrophvm были охарактеризованы как организмы, облигатно зависящие от элементной серы и при органотрофном росте осуществляющие полное окисление сложных органических субстратов до С02 и HgS (Zillig et al., 1981, Stetter et al., 1983, Huber et al., 1988). Для большинства представителей третьей группы - облигатных органотрофов - была показана возможность слабого роста в отсутствие серы за счет брожения органических субстратов, однако их рост в присутствии серы также характеризовался как "серное дыхание".
Способность восстанавливать элементную серу за счет окисления молекулярного водорода была также обнаружена у факультативно-анаэробных архебактерий p. Acldtamia и Deaulfurolobua, которые в аэробных условиях росли за счет окисления серы кислородом (Segerer et al., 1986, Zillig et al., 1986).
Особое значение цикла серы было установлено для биоценозов глубоководных гидротерм (Jannasoh, Mottl, 1985). где был впервые обнаружен "тиобиос" - биоценоз, основанный на использовании энергии вулканического сероводорода симбиозом беспозвоночных и хемолито-трофных бактерий. В глубоководных горячих источниках также содержатся многочисленные популяции экстремально термофильных органо-трофных архебактерий, нуждающихся в элементной сере (Belkin, Jannasoh, 1985, Pledger, Barross, 1989).
Таким образом, к моменту начала нашей работы в 1982 году существовал устойчивый интерес к микробным сообществам гидротерм: были подробно охарактеризованы продукционные и деструкционные процессы в термофильных цианобактериальных матах, шло интенсивное выделение новых термофильнах анаэробов, была только что открыта новая группа архебактерий с серным дыханием. Работы как зарубежных, так и русских микробиологов указывали на особую роль элементной серы в микробиологических процесах термальных местообитаний. Вместе с тем значение процесса бактериальной сероредукции для микробных сообществ гидротерм не исследовалось. В силу высокого температурного интервала развития экстремально термофильных архебактерий они не могли входить в состав таких продукционных сообществ как цианобактериаль-ные маты; умеренно термофильные бактерии, восстанавливающие элементную серу, известны не были.
Цель и задачи исследования
Целью исследования являлось определение роли сероредуцирувдш! бактерий в микробных сообществах гидротврм с различными физико-химическими условиями.
Для достижения цели были поставлены конкретные задачи:
1. Определение распространения и численности сероредуцирующш
бактерий в гидротермах различного типа.
2. Выделение чистых культур термофильных сероредуцирующиз
бактерий и определение их таксономического положения.
-
Исследование особенностей физиологии и биохимии выделенные бактерий и роли элементной серы в их метаболизме.
-
Определение скорости бактериальной сероредукции in attu.
-
Определение значения процесса бактериальной сероредукции для микробных сообществ гидротерм различного типа.
Научная новизна и значимость работы.
Расширены представления о биоразнообразии прокариотных организмов, в частности, умеренных и экстремальных термофилов. Выделены и охарактеризованы новые таксоны прокариот, представители которых осуществляют процесс восстановления элементной серы.
На примере новых организмов исследованы различные случаи влияния элементной серы на катаболизм анаэробов. Показано, что физиологический смысл сероредукции различается у разных групп термофилов, и определяет их роль в циклах углерода и серы в гидротермах. Для широкого круга экстремально термофильных архебактерий, первоначально описанных как организмы с серным дыханием, установлена связь стимулирующего действия элементной серы,-с удалением молекулярного водорода, образующегося при брожении. Это же явление обнаружено в группе умеренно термофильных органотрофных эубактерий. Открыта новая группа умеренно термофильных бактерий с серным дыханием, представленная новым родом Desulfurella и способная к полному окислению широкого спектра несбраживаемых субстратов. Спектр органических субстратов, которые могут быть окислены анаэробно в процессе бактериальной сероредукции, существенно расширен.
Процесс бактериального восстановления элементной серы исследован с точки зрения его вклада - как потенциального, так и реального - в биогеохимические циклы углерода и серы в гидротермах. Установлено, что бактериальная сероредукция может служить эффективным механизмом анаэробной деструкции: как влияя на первую стадию - брожение органических субстратов, так и выступая в качестве универсальной терминальной реакции окисления продуктов брожения.
Практическая ценность.
Создана уникальная коллекция экстремально и умеренно термофильных архе- и эубактерий, восстанавливающих элементную серу, содержащая большое количество штаммов - продуцентов термостабильных ферментов: ДНК-полимераз, протеаз, амилаз и др. и служащая базой для новой ветви биотехнологии. Исследована физиология новых организмов, разработаны методы их массового культивирования.
Установленная роль бактериальной сероредукции как значимого биогеохимического процесса обуславливает необходимость учитывать вклад этого процесса в циклы углерода и серы в различных биотопах,
как термальных, так и мезофильных.
Апробация роботи.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Термофильные микроорганизмы: теория и практика" (Москва, 1984 ), на IX Международном микробиологическом конгрессе (Манчестер, 1986), на Международном симпозиуме по литоавтотрофии (Геттин-ген, 1987), на їх Международном симпозиуме по Оиогеохимии окружающей среды (Москва, Г989), на Билатеральном симпозиуме СССР-ФРГ па архебактериям (Тбилиси, 1990), на Международном симпозиуме по морской биотехнологии (Балтимор, 1991).
Публикации.
Основные материалы диссертации содержатся в 40 печатных работах: 26 экспериментальных статьях, 5 обзорах, 9 тезисах.
Место проведения работы.
Основная часть работы проводилась в Институте микробиологии РАН в лаборатории микробных сообществ, руководимой членом-корреспондентом РАН профессором Г.А. Заварзиным. Б отдельных этапах работы принимали участие сотрудники лаборатории М.Л. -Мирошниченко, М.А. Пушева, Т.Г. Соколова, стажер Е.В. Пикута. В начальных этапах работы участвовал аспирант ИЙГАН А.И. Слесарев. Полевые исследования в районах современной поствулканической активности проводились в сотрудничестве с В.М. Горленко, Б.Б. Намсараевым, В.А. Светличным, Д.Ю. Сорокиным (ИНММ РАН), Г.А. Карповым (Институт вулканологии ДВНЦ РАН), В.Г. Тарасовым (Институт биологии моря ДВНЦ РАН), В.А. Алексеевым (ФИАЭ им. Курчатова). Определение форм серы в пробах из гидротерм проводили в Институте океанологии РАН под руководством Н.Н. Жабиной. Электронно-микроскопические исследования новыз организмов проводились в ИНМИ РАН сотрудниками лаборатории цитологии Н.А. Кострикиной и Т.П. Светличной, а также в Институте биофизики РАН (Пущино) Г.М. Гонгадзе. Геносистематические исследованш проводились A.M. Лысенко и Н.А. Черных (ИНМИ РАН) , а также (совместно с А. Нойнер) на кафедре микробиологии Университета Регенс-Оурга (ФРГ), руководимой профессором К.О. Штеттером. Там же проводилось исследование межвидового переноса водорода в бинарных куль-
турах экстремально термофильных архебактерий. Особенности биохимии умеренно термофильных сероредуцирующих эубактерий исследовались Р. Шмитц в лаборатории профессора Р.К. Тауэра (Университет Марбурга, ФРГ). Белковый состав клеточных стенок архебактерий был исследован научным сотрудником Института белка РАН А.Ю. Костюковой. Способность органотрофных умеренно термофильных эубактерий к сероредукида - совместно с В.В.Кривенко в ИНМИ РАН.
Автор выражает глубокую признательность своему учителю Георгию Александровичу Заварзину, всем упомянутым участникам работы, а также друзьям и родным - за благожелательный интерес и поддержку.
Основные защищаелне положения.
-
Способность восстанавливать элементную серу в процессе роста широко распространена среди анаэробных термофильных бактерий, входящих в состав микробных сообществ гидротерм и различающихся по своей экологии, физиологии, таксономическому*положению.
-
Экстремально термофильные архебактерий восстанавливают элементную серу в процессе органотрофного роста. Этот процесс не является облигатным и может не реализовываться в природных условиях. Для ряда органотрофных бактерий показана его связь с удалением водорода, оказывающего ингибирующее действие на процесс брожения. Элементная сера может быть замещена водород-потребляющими метаноге-нами, обеспечивающими межвидовой перенос водорода.
-
Среди умеренно термофильных эубактерий, восстанавливающих элементную серу, встречаются как органотрофы, осуществляющие брожение, так и облигатно зависящие от серы бактерии с серным дыханием. Последние способны полностью окислять широкий спектр органических соединений.
-
В сообществах умеренно термофильных бактерий с постоянно возобновляемым пулом элементной серы процесс бактериальной сероре-дукции является ведущим терминальным процессом анаэробной деструкции, обуславливая полную минерализацию органического вещества.
-
Бактериальная сероредукция'в микробных сообществах гидротерм может являться биогеохимически значимым процессом и важным пунктом сопряжения анаэробных циклов углерода и серы.