Содержание к диссертации
Введение 4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Таксономия рода Alternaria 8
Современное состояние и проблемы таксономии рода Alternaria 8
Виды Alternaria в микобиоте злаков и их таксономический статус 15
Филогения видов Alternaria 23
Внутривидовое разнообразие и структура популяций видов Alternaria 26
Паразитические свойства грибов рода Alternaria 29
Альтернариозы злаков 29
Патогенность 37
Токсины 38
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43
Сбор растительного материала и изоляция грибов в чистую культуру 43
Идентификация видов на основе изучения морфолого-культуральных свойств 44
молекулярно-генетические методы 47
Общие методические подходы 47
Экстракция ДНК 48
2.3.3.RAPDHyn-nUP 51
AFLP 52
Конструирование специфичных праймеров 53
ПЦР со специфичными праймерами 57
Секвенирование рДНК 57
2.4. Исследование физиологических свойств видов Alternaria 58
2.4.1. Патогенность 58
2.4.2. Токсигенность
2.5. Обработка и анализ данных 61
Глава 3. ВИДОВОЙ СОСТАВ ГРИБОВ РОДА ALTERNARIA НА ЗЛАКАХ..63
3.1. Идентификация видов 63
Идентификация по морфологическим признакам и культуральным свойствам 63
ПЦР-диагностика 76
3.2. Уточнение таксономического положения видов и их
филогении 79
Уточнение таксономии мелкоспоровых видов Alternaria 79
Дифференциация видов комплекса A infectoria 86
Филогения мелкоспоровых видов Alternaria 92
Глава 4. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВИДОВ ALTERNARIA НА ТЕРРИТОРИИ
РОССИИ, ИХ ПАТОГЕННОСТЬ И ТОКСИГЕННОСТЬ 96
Распространение видов 96
Заражённость семян злаков видами Alternaria 99
Патогенность мелкоспоровых видов Alternaria 104
Токсигенность мелокоспоровых видов Alternaria 107
Глава 5. СТРУКТУРА ГЕОГРАФИЧЕСКИХ ПОПУЛЯЦИЙ А
TENUISSIMA 111
Сравнение популяций по фенотипическим признакам 111
Изучение структуры популяций по генетическим маркерам .. 113
Выводы 119
Практические рекомендации 120
Список литературы 121
Приложение 149
Введение к работе
Актуальность темы. Род Alternaria представляет собой большую и разнообразную по биологическим характеристикам группу микромицетов, многие из которых распространены очень широко. Среди представителей этого рода известны виды с разной степенью паразитизма (от сапротрофов до био-трофов), уровнем специализации и своеобразными взаимоотношениями с растениями-хозяевами и другими организмами. Виды рода Alternaria часто обнаруживаются на злаках и считаются возбудителями чёрного зародыша и листовой пятнистости зерновых культур во многих странах мира. Они способны «загрязнять» зерно своими метаболитами, токсичными не только для растений, но и для человека и животных (Тутельян, Кравченко, 1985). Однако слабая изученность и запутанность таксономии рода служит серьёзным препятствием для его изучения.
За последние 20 лет, благодаря работам американского миколога Э. Симмонса (Simmons, 1986, 1990, 1992, 1993, 2002), систематика рода Alternaria значительно продвинулась вперёд. Тем не менее, до сих пор распространены ошибки при идентификации видов, что отражается на представлении об их ареалах, субстратной приуроченности и других экологических характеристиках (Левкина, 2003). Поэтому крайне актуальным в настоящее время является уточнение видовой принадлежности представителей рода Alternaria, в частности приуроченных к злакам. Решение этой задачи облегчают современные молекулярно-генетические методы исследований, успешно применяемые в систематике и популяционной биологии грибов (Taylor et al., 1999; Мироненко, 2004).
Цель исследований. Провести инвентаризацию видового состава грибов рода Alternaria, распространённых на растениях семейства злаковых (Роасеае) в разных регионах России, установить их таксономическое положение, филогенетические связи и внутривидовое разнообразие.
Задачи исследований. 1. Оценить распространение грибов рода Alternaria на зерновых культурах в различных регионах России.
Создать коллекцию чистых культур видов рот Alternaria.
Идентифицировать виды с использованием традиционных и современных молекулярно-генетических методов.
Уточнить таксономический статус выявленных видов и их филогенетические связи с другими представителями рода, основываясь на морфологических, культуральных и молекулярно-генетических признаках.
Выявить доминирующие на злаках виды рода Alternaria и определить их ареалы.
Изучить полиморфизм доминирующих видов по патогенносте, токсигенности и молекулярно-генетическим маркерам.
Провести анализ генетических различий пространственно отдаленных популяций доминирующих видов.
Научная новизна работы. Впервые в России целенаправленно исследованы распространённые на злаках виды рода Alternaria и виды других фео-диктиоспоровых гифомицетов. Проведена идентификация видов, основанная на современных работах по систематике этой группы грибов. Из девяти обнаруженных нами таксонов (8 видов и один комплекс видов) идентифицированы два новых для России вида: A. photistica Е. G. Simmons и Embellisia chlamydospora [Hoes et ah] E. G. Simmons. Для доминирующих видов впервые установлены границы ареалов в пределах России.
При инвентаризации видового состава грибов рода Alternaria, консор-тивно связанных со злаками, впервые использованы молекулярно-генетические методы, что позволило уточнить таксономический статус видов и их филогению.
Впервые исследована и охарактеризована структура популяций А. tenuissima [Fries] Wiltshire. Определены генетические дистанции между тремя
географически разобщенными популяциями этого вида, установлена степень изоляции, генное и генотипическое разнообразие.
Практическая значимость. Впервые сконструированы праймеры для идентификации комплекса видов A. infectoria с использованием полимераз-ной цепной реакции (ПЦР), установлена специфичность некоторых существующих праймеров. Усовершенствованные методы идентификации позволят эффективнее проводить мониторинг видового состава грибов и оценивать степень заражённости семян зерновых культур видами \>oj№.Alternaria.
Апробация работы. Результаты исследований обсуждались на заседаниях Лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР и группы биотехнологии Центра защиты растений Норвежского института исследования сельскохозяйственных культур (Norwegian Crop Research Institute), а также были представлены на 9-й съездах, конференциях и семинарах: Первом съезде микологов России (Москва, 2002); Международном микологическом конгрессе (Осло, 2002); Первом всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003); Всероссийском координационном совещании «Разработка биотически управляемых, устойчиво развивающихся агроэкосистем на основе защиты сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург, 2003); Конференции молодых учёных «Микология и альгология - 2004» (Москва, 2004); Международном семинаре «New emerging mycotoxins and toxigenic fungi in Northern Europe» (Санкт-Петербург, 2004); Международной конференции, посвященной столетию с начала работы профессора А. С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В. Л. Комарова РАН (Санкт Петербург, 2005); Конференции по защите растений «Вопросы менеджмента в защите растений и устойчивом земледелии: исследования, развитие и информационные системы» (Санкт-Петербург, 2005); Втором всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Место проведения исследований. Большая часть исследований проведена в Лаборатории микологии и фитопатологии Всероссийского НИИ защиты растений. Некоторые разделы экспериментальных исследований были выполнены в Лаборатории физиологии растений и молекулярной биологии Университета г. Турку (Финляндия) и в группе биотехнологии Центра защиты растений Норвежского института исследования сельскохозяйственных культур.
Работа выполнена при поддержке Российской академии сельскохозяйственных наук, Министерства науки Норвегии (персональный грант № Rus03/04-89), Финского научного фонда CIMO (персональный грант № ТМ-04-2097) и международного научного фонда NordForsk (Nordic) (гранты №№ FIN 11 и 040291).
