Содержание к диссертации
Стр.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
Систематическое положения P. infestans 8
Биология, цикл развития, эпидимиология 8
Агрессивность и вирулентность P. infestans 12
Обзор лабороторных методов изучения признака агрессивности Р. V infestans 14
Селекция штаммов фитопатогенных грибов в бесполых генерациях...23
Семейства коротких диспергированных элементов в геноме Phytophthora infestans. 26
Молекулярные маркеры и их использование для исследования генома P. infestans и других организмов 28
ПДРФ-маркеры 30
Полимеразная цепная реакция 32
ДНК-маркеры, основанные на полимеразной цепной реакции 33
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45
Штаммы, используемые в работе, их свойства и культивирование 45
Оценка изменения агрессивности изолятов P. infestans в ходе пассажей через листья растений 47
Оценка агрессивности изолятов по отношению к клубням картофеля 48
Выделение нуклеиновых кислот из мицелия P. infestans и синтез кДНК 48
Базы данных последовательностей ДНК и стратегия поиска 50
Условия амплификации с праймерами к боксам А и В и Саузерн
4 перенос на фильтр 51
Фильтры, содержащие бактериальные клоны высокой плотности 53
Мечение проб и гибридизация ДНК 53
Клонирование ГЩР-продуктов 54
Секвенирование клонированных фрагментов 55
разработка метода HHTep-SINE-ITUP 55
Математический анализ результатов интер-SINE-nHP 58
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 59
Консенсусные последовательности для промотора РНК-полимеразы III (А и В боксы) 59
Предсказание тРНК и последовательностей SINE из P. infestans 60
Число копий и геномная организация предполагаемых последовательностей SINE 66
Транскрипция последовательностей SINE у P. infestans 70
Распределение последовательностей SINE, встречающихся у Р. infestans, внутри рода Phytophthora 71
Характеристика прай мера и спектров интер-SINE-nUP 77
Индивидуальная и географическая изменчивость 78
Изучение изменчивости агрессивности изолята P. infestans при пресевах на живых листьях картофеля 82
Реципрокное заражение растений-хозяев изолятами, выделенными из картофеля и томатов 85
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 99
4 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ИПТГ - изопропилгалактозид
пн - единица длины молекулы ДНК, равная паре нуклеотидов
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
СТАВ - cetyltrimethyl ammonium bromide (гексадецилтриметилбромид
аммония)
SDS - sodium dodecylsulfate (додецилсульфат натрия)
X-Gal — 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-В-галактозид
Введение к работе
Актуальность проблемы. Паразитическая фаза жизненного цикла большинства фитопатогенных грибов протекает в бесполых генерациях. При этом для многих видов установлено изменение паразитических свойств (агрессивности и вирулентности) в процессе роста численности при эпифитотиях [Рыбакова, Дьяков, 1990, Дьяков, 1998]. Поскольку половая рекомбинация не принимает или почти не принимает участия в этих изменениях, они могут быть обусловлены отбором более агрессивных штаммов, находившихся в исходно гетерогенной популяции или возникших вследствие мутаций, парасексуального процесса или канализованной изменчивости, вызванной изменением локализации в геноме мобильных элементов.
Геном большинства эукариот содержит повторяющиеся последовательности ДІЖ. Многие из них являются транспозонами. Среди них встречаются длинные терминальные повторы (LTR, Long Terminal Repeats), длинные диспергированные элементы (LINEs, Long Interspersed Elements) и короткие диспергированные элементы (SINEs, Short Interspersed Elements ). SINEs отличаются от других транспозонов присутствием внутреннего промотора РНК полимеразы III. Как было показано, большинство SINEs проявляют свойства, родственные генам, транскрибируемых РНК полимеразой III [Ullu and Tschudi, 1984]. Структурно эти элементы обладают внутренним промотором из А и В боксов для РНК полимеразы III, обладают типичной структурой клеверного листа тРНК на 5' конце, имеют аденозин-богатый 3'-хвост вариабельной длины, после которого следует олиготимидиновая последовательность .Короткие диспергированные элементы были обнаружены в геномах таких различных эукариот, как грибы, рыбы, растения, млекопитающие и насекомые [Feschotte et al., 2001; Ogiwara et al., 2002].
Короткие диспергированные элементы и другие транспозоны часто описывались как геномные паразиты без функциональной роли. Однако, эти элементы могут играть важную роль в геномной эволюции многих организмов. Например, инсерционная инактивация генов может происходить при встраивании SINE как в кодирующую область гена, так и в интрон (что приводит к ненормальностям в сплайсинге РНК), является причиной геномных перестроек или стимулирует трансляцию при условиях клеточного стресса [Deininger et al., 2003; Rubin et al., 2002]. Также было установлено, что SINEs могут служить генетическими маркерами, позволяющими получать надежную информацию о филогенезе таксономических групп среднего уровня - семейств и отрядов, а также о популяционной изменчивости [Shtmamura et al., 1997; Serdobova, Kramerov, 1998].
Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу - один из наиболее интенсивно изучаемых и вредоносных видов оомицетов, и при его изучении активно используются многие геномные ресурсы [Lam, 2001; Waugh et al., 2000]. Наличие ретротранспозонов у P. infestans в активном состоянии частично может объяснить высокую приспособляемость этого растительного патогена. Однако, было неизвестно, существуют ли такие классы ретротранспозонов, как последовательности LINE или SINE и до какой степени они распространены в геноме P. infestans. Поэтому в данной работе исследовалась возможность присутствия тРНК-родственных SINEs в геноме P. infestans. Разнообразие семейств коротких ретропозонов вместе с их распределением в пределах рода Phytophthora может также показать, имеют ли они важное значение в эволюции P. infestans. Также представляло интерес изучить возможное влияние SINEs на межштаммовую (штаммы из удаленных местообитаний) и внутриштаммовую (селекция штаммов на агрессивность) изменчивость у P. infestans.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение коротких ретропозонов (SINEs) в геноме Phytophthora infestans и оценка их применимости для сравнительного анализа штаммов и для г идентификации
7 генетических изменений при селекции изолятов в бесполых генерациях. Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:
Идентифицировать и охарактеризовать тРНК-родственные короткие диспергированные элементы (SINEs) в геноме P. infestans
Изучить возможности применения коротких ретропозонов для сравнительного анализа штаммов из географически удаленных мест обитания и с разных растений хозяев
3 Проанализировать морфологические и молекулярные изменения штаммов после селекции на повышение и понижение агрессивности в бесполых генерациях на разных растениях-хозяевах.
