Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Основные умс-регуляторные элементы 9
Регуляция эмбрионального развития Drosophila melanogaster 11
Bithorax комплекс. Фазы регуляции 15
Регуляция Abdominal-B гена 21
Fab-7 24
Fab-8 27
Мер 30
1.5 Существующие модели регуляции Abd-B гена 33
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 37
2.1 Генетические методы 37
Линии и мутации Drosophila melanogaster 37
Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение
трансгенных линий 38
2.1.3 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в
трансгенных линиях 38
2.1.4 Генетические скрещивания 40
2.2 Биохимические методы 42
Выделение ДНК из дрозофилы 42
Саузерн-блот-анализ 42
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) 43
2.2.4 Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов 44
2.2.5. Молекулярное клонирование 44
Трансформация бактериальных клеток плазмидами 45
Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса 45
Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 46
Создание конструкций 46
3 РЕЗУЛЬТАТЫ 51
Мер755 содержит инсулятор 51
Элементы Мер, содержащие минимальный инсулятор в своем составе, способны к функциональному взаимодействию 57
Взаимная ориентация взаимодействующих Мер элементов определяет способность глазных энхансеров стимулировать ген white 59
Стимуляция white промотора активатором GAL4 также зависит от взаимной ориентации взаимодействующих Мер элементов 65
Мер34 способен защищать промотор от репрессирующего действия PRE 69
Мер способствует репрессии, опосредованной прилегающим ..сайленсером72
4 ОБСУЖДЕНИЕ 75
Инсулятор размером 210 пн является функциональным центром Мер 75
Создание модельной системы с использованием дрожжевого GAL4 активатора для проверки способности регуляторных элементов взаимодействовать на больших дистанциях 78
4.3 Модель регуляции Abd-B гена 80
ВЫВОДЫ 84
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
А - абдоминальный сегмент
abd-A - abdominal А
Abd-B - Abdominal-B
ANT-C - Antennapedia complex
bcd-bicoid
BRM - Brahma комплекс
BX-C - bithorax complex
CMM - cellular memory module -модуль клеточной памяти
CTCF - CCCTC связывающий фактор
dCBP - CREB связывающий белок
DSP1 - dorsal switch protein 1
E(z) - Enhancer of zeste
ESC - Extra sex comb
Fab - Frontabdominal
FRT - Flp recombination target - сайт для сайт-специфической рекомбиназы Flp
GAF - GAGA factor
hb - hunchback
Hox - гомеозисный
HS - hypersensitive -сайт гиперчувствительности к ДНКазе I
iab - infraabdominal
kni - knirps
Kr - Kruppel
lox - сайт для сайт-специфической рекомбиназы Cre
Мер - Miscadestral pigmentation
Mod(mdg4) - Modifier of mdg4
nos - nanos
Pc - polycomb
Pcq - Pipsqueak
Ph - Polyhomeotic
Pho - pleiohomeotic
PRCl (2) - Polycomb repressive complex 1 (2)
PRE - Polycomb response element(s)
Su(Hw) - Suppressor of Hairy-wing
Su(z)12 - Supressor of zeste
TAC1 - trithorax acetylation complex
TAF(s) - TBP-associated protein(s)
TBP - TATA binding protein
TRE - Trithorax Response Element(s)
trl - trithorax-like
trxG - Trithorax group proteins
UAS - upstream activating sequence
Ubx - Ultrabithorax
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
пн - пар нуклеотидов
РНК - рибонуклеиновая кислота
тпн - тысяч пар нуклеотидов
Введение к работе
Многообразие генов высших эукариот, одни из которых должны работать в строго определенное время и только в определенных тканях, а другие наоборот, всюду и постоянно, подразумевает наличие сложной и высокоэффективной системы регуляции их экспрессии. Работу каждого гена определяют и контролируют специальные z/мс-регуляторные элементы, активирующие транскрипцию (энхансеры) или репрессирующие ее (сайленсеры). Организация и упаковка хроматина, формирование внутри ядра определенных хромосомных территорий и компартментов, содержащих регуляторные белковые комплексы, также оказывают влияние на транскрипционный статус гена. Было показано, что геном дрозофилы организован в домены одинаковыми паттернами экспрессии генов (Boutanaev et al. 2002, Spellman & Rubin 2002). Формирование независимых функциональных доменов, предполагает наличие специальных элементов, защищающих от позитивного или негативного влияния соседствующего хроматина и модулирующих энхансер-промоторные взаимоотношения. Принято считать, что функцию разграничения доменов выполняют специальные элементы, которые называются инсуляторами. Инсуляторы - это г/ис-регуляторные элементы, которые способны функционально изолировать промотор от энхансера, если располагаются между ними, а также ограничивать распространение репрессии, то есть, защищать от эффекта положения (Cai & Levine, 1995; Gerasimova & Corces, 1996).
Обращает на себя внимание, что очень часто г/г/с-регуляторная область и промотор гена находятся на расстоянии десятков тысяч пар нуклеотидов друг от друга, кроме того, между геном и его г/морегуляторной областью может располагаться ген с другой программой экспрессии, и гены могут перекрываться.
Поэтому для правильного запуска работы гена важно, чтобы энхансер активировал только «свой» специфичный промотор. Современные экспериментальные данные подтверждают предположение, что между активаторными белками, собранными на энхансере, и преинициаторным комплексом на промоторе происходят прямые взаимодействия с выпетливанием участка ДНК, расположенного между ними (Fraser et al, 2005; Petraschek et al., 2005; de Laat & Grosveld, 2003). Однако механизмы, которые обеспечивают специфические взаимодействия между энхансерами и промоторами на больших дистанциях до сих пор неизвестны.
Одной из наиболее удобных моделей для изучения энхансер-промоторных взаимодействий и изучения роли инсуляторов в регуляции этих взаимодействий является гомеозисный ген Abdominal-B (Abd-B) Drosophila melanogaster, который отвечает за формирование с 10 по 14 брюшные парасегменты дрозофилы. Регуляторная область Abd-B гена простирается приблизительно на 50 тпн и включает в себя четыре парасегмент-специфичные г/г/с-регуляторные единицы: iab-5 (infraabdominal-5), iab-6, iab-7 и iab-8, каждая из которых содержит, по меньшей мере, один энхансер и ответственна за формирование соответствующего ей парасегмента. При этом энхансеры располагаются на хромосоме в том же порядке, что и парасегменты. Молекулярно-генетический анализ выявил наличие границ между этими регуляторными единицами: Мер (Miscadestral pigmentation), Fab-7 (Frontabdominal-1) и Fab-8. Было показано, что Fab-7 и Fab-8 являются инсуляторами (Karch et al., 1994; Hagstrom et al., 1996). Кроме того, к каждой границе вплотную прилегает сайленсер, включающий сайты связывания белков группы Polycomb (Polycomb Responsible Elements или PRE). Получается, что каждый энхансер окружен инсуляторами и саиленсерами, но при этом способен активировать свой промотор в нужное время и в нужном месте. Данная
противоречивая ситуация наводит на мысль о более сложной структуре граничных элементов и их особенной роли в обеспечении правильных энхансер-промоторных взаимодействий. Более пристальное изучение каждой границы по отдельности позволит понять роль этих элементов в регуляции экспрессии Abd-B гена и предположить модель, объясняющую механизм коммуникации между энхансером и промотором, разделенных несколькими инсуляторами.
Целью настоящей работы стало изучение регуляторной границы Мер, разделяющей iab-4 и iab-5 домены (Lewis, 1978; Karch et al., 1994). На основании литературных данных мы предположили структуру Мер, и, используя молекулярно-генетический анализ этого элемента, изучили функции отдельных его элементов.
Для изучения способности Мер элементов взаимодействовать друг с другом на больших дистанциях была разработана новая модельная система с использованием дрожжевого активатора GAL4 и генов yellow и white.
