Содержание к диссертации
Список сокращений 4
Введение 5
Аминоацил тРНК синтетазы 7
Альбомицин 10
Агроцин 84 12
МикроцинВ17 13
Микроцин С 17
Микроцин J25 20
Пептидазы Е. coli 24
Аминопептидаза А 25
Аминопептидаза В 29
Аминопептидаза N 32
Метиониновая аминопептидаза 38
Олигопептидаза А 42
Дипептидаза D 42
ПептидазаТ 43
Материалы и методы 47
Бактериальные штаммы 47
Питательные среды 47
Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость к антибиотикам.. .47
Электрофорез в агарозном геле 47
Процессинг микроцина С 48
Метод ПЦР 48
Извлечение фрагментов ДНК из агарозы 49
Биоинформатический анализ белков 49
Очистка микроцина С 50
Получение S30 50
Получение S-100 51
Выделение плазмид 51
Очистка ДНК от белковых примесей 53
Транскрипция in vitro 53
Трансформация клеток E.coli 54
Переосаждение ДНК 55
Реакция аминоацилирования 55
ТХУ осаждение белков 56
Синтез люциферазы in vitro 56
Результаты и обсуждение 58
Процессинг микроцина С делает его активным in vitro 58
Внутриклеточная мишень процессированного МсС 60
Процессированный микроцин подавляет первую стадию реакции
аминоацилирования 65
Устойчивость клеток к МсС повышается при суперпродукции Asp-RS 66
Структура процессированного МсС 68
Процессированный МсС подавляет работу эукариотической тРНК синтетазы 70
Связывание процессированного МсС и мишени очень прочно 70
Процессинг микроцина С в цитоплазме клетки-мишени 72
Любая из аминопептидаз А, В или N способна процессировать МсС 73
Клетки, лишённые пептидаз, производят деформилированный микроцин 75
Стадия деформилирования занимает половину времени процессинга интактного
микроцина 75
Формильная группа МсС требуется для эффективного транспорта внутрь клетки-
мишени 77
Структурно-функциональный анализ микроцина С 77
Изменение аминокислотного состава лидерного пептида может привести к
изменению активности МсС 79
Выводы 84
Публикации автора по теме диссертации 85
Список цитируемой литературы 86
Список сокращений
А - аденин
ARS (aaRS)- аминоацил-тРНК синтетаза
аа-тРНК - аминоацилированная тРНК
АТР (АТФ) - аденозинтрифосфорная кислота
cpm - counts per second
СТР (ЦТФ) - цитидинтрифосфорная кислота
G - гуанин
GTP (ГТФ) - гуанозинтрифосфорная кислота
Да - Дальтон
DMSO (ДМСО) - диметилсульфоксид
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
IPTG (ИПТГ) — изопропилтиогалактозид
МсС - микроцин С
мРНК (mRNA) - информационная (матричная) РНК
dNTP - смесь дезоксирибонуклеотидов (dGTP, dATP, dTTP и dCTP)
ПААГ - полиакриламидный гель
о.е. - оптические единицы
PCR (ПЦР) - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
SDS (ДСН) - додецилсульфат натрия
тРНК (tRNA) - транспортная РНК
ТТР (ТТФ) - тимидинтрифосфорная кислота
U (ед.) — единица активности фермента
UTP (УТФ) - уридинтрифосфорная кислота
Введение к работе
Для успешного выживания в условиях конкуренции с окружающими их организмами бактерии выработали ряд приспособлений, одним из которых является продукция антимикробных веществ. Антимикробные вещества, производимые бактериями, делятся на синтезируемые ферментативно и на те, которые кодируются генами и синтезируются на рибосомах. Микроцины - антимикробные вещества, закодированные в геноме бактерий и синтезируемые путем трансляции на рибосомах. Микроцины являются важным компонентом экологии микроорганизмов и многообещающим классом антибиотических веществ. Среди разнообразия этих антибиотиков особое место занимают микроцины, имеющие цитоплазматические мишени в поражаемых клетках. Такие микроцины имеют крайне необычные структуры и ингибируют рост чувствительных клеток проникая в цитоплазму и действуя на внутриклеточные мишени, такие как ДНК-гираза, ДНК-зависимая РНК-полимераза и аспартил-тРНК-синтетаза.
Микроцин С (МсС) - антибактериальный нуклеотид-гептапептид, продуцируемый некоторыми штаммами Е. coli. МсС действует на многие грам-отрицательные, а так же, в отличие от других микроцинов, на грам-положительные бактерии.
Гены, необходимые для продукции микроцина С расположены на плазмиде природного происхождения (плазмида pUHAB - производное такой плазмиды), тссА, тссВ, mccD и тссЕ участвуют в продукции МсС, а тссС и тссЕ в экспорте микроцина из клетки и иммунности к нему. Все вместе они образуют один оперон, первым в котором идет 21 нуклеотидная пара гена тссА, кодирующего пептидную часть МсС. Таким образом, тссА является самым коротким из известных генов. В процессе синтеза микроцина С гептапептид, продукт гена тссА, подвергается значительным изменениям, механизм осуществления которых до конца неясен. С-концевой аспарагин МссА дезаминируется, превращаясь в аспарагиновую кислоту, к которой присоединяется остаток АМФ (через фосфоамидатную связь). Остаток АМФ также модифицирован, путем присоединения пропиламина к фосфатной группе. Как реализует свои антибактериальные свойства эта химерная структура, оставалось не ясным. В данной работе мы показываем, что микроцин С относится по своему принципу действия к интереснейшей группе антибиотиков - троянских коней. Принципиальное отличие таких антибиотиков состоит в том, что в интактном состоянии они не являются ингибиторами какого-либо клеточного процесса. Клетка-мишень сама транспортирует их в цитоплазму, где подвергает их модификации (процессингу), например, гидролизуя какие-то связи в
антибиотике. Этот ряд действий со стороны клетки-мишени высвобождает активную часть антибиотика, которая ингибирует свою внутриклеточную мишень. Таким образом клетка-мишень сама делает всё, чтобы себя убить.
Изучение микроцинов интересно само по себе, так как они отличаются необыкновенно изощренными и непохожими между собой структурами, образующимися в результате посттрансляционных модификаций. Кроме того, изучение механизмов действия микроцинов способствует получению ценных сведений о работе и структуре их мишеней - ключевых ферментов в жизнедеятельности бактерий. Троянский конь, как модель действия антибиотика, становится более актуальна с учётом развития устойчивости у патогенных микроорганизмов к стандартным антибактериальным веществам. С практической же точки зрения микроцины и их более активные производные, полученные искусственным путем, могут найти применение как при лечении бактериальных инфекций (микроцины; активны против ряда патогенных микроорганизмов), так и как консерванты в пищевой промышленности. В случае микроцина С, появляется возможность изучать не только белки его транспорта, мишень (аспартил-тРНК-синтетазу), но и ферменты, которые осуществляют его процессинг. В данной работе мы находим все ответственные за процессинг белки - пептидазы и деформилазу. Возможность внесения изменений в микроциновый ген, кодирующий пептидную часть антибиотика, может позволить изучать механизм деградации олигопептидов в клетке.
