Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы активно исследуются механизмы постгрансляционной регуляции и функционирования активируемых транскрипционных факторов, контролирующих важнейшие клеточные процессы. Одним из наиболее интересных белков этой группы является открытый в 1986 году NF-kB. Транскрипционный фактор NF-kB играет важную роль в воспалительных реакциях, иммунном ответе, пролиферации, трансформации, апоптозе и других процессах. В неактивированных клетках комплексы NF-kB связаны с молекулами-ингибиторами семейства 1-кВ, куда входят белки 1-кВа, I-кВр и другие. Молекулы 1-кВ блокируют сигналы ядерной локализации NF-kB и удерживают NF-kB комплексы в цитоплазме, где те неактивны. Внешние сигналы, такие как ФИО (фактор некроза опухолей а), ультрофиолетовое излучение, активные формы кислорода и др. активируют пути, приводящие к деградации молекул 1-кВ, что приводит к транслокации NF-kB в ядро. В ядре NF-kB комплексы связываются с регуляторпыми областями и активируют транскрипцию генов-мишеней, многие из которых имеют антиапоптотическую функцию.
В большинстве тканей и клеточных линий базальный уровень ядерного NF-kB сравнительно невысок. Тем не менее, существуют некоторые типы клеток (В-лимфоциты, гепатоциты, клетки, специфичные для болезни Ходжкина, некоторые опухоли) с аномально высоким уровнем NF-kB. Было показано, что во многих из этих клеток искуственное понижение уровня NF-kB приводит к гибели клеток. Механизмы поддержания высокого конститутивного
уровня NF-кВ достаточно плохо изучены. Известно, что в клетках В-лимфомы WEHI-231 высокий уровень NF-кВ обеспечивается за счет активности Са" -зависимой протеиназы, поддерживающей короткое время жизни І-кВа. В клетках болезни Ходжхина тот же эффект достигается за счет того, что в этих клетках экспрессируется мутантная укороченная форма І-кВа. В Т-лимфомах высокий конститутивный уровень ядерного NF-кВ ингибируется обработкой антителами к TNFa.
В настоящей работе мы исследовали механизмы поддержания высокого конститутивного уровня NF-кВ и последствий его понижения в двух клеточных линии аденокарцином мыши КСМЛ-100 и КСМЛ-0. Уровень NF-кВ аномально высок в обоих типах клеток, хотя в КСМЛ-100 он значительно выше, чем в КСМЛ-0. На ранней стадии выполнения работы было обнаружено, что между стабильностью белков І-кВа в этих клетках существует обратная корреляция -1-кВос стабилен в клетках КСМЛ-100 и имеет короткое время жизни в клетках КСМЛ-0, что, казалось бы, должно было приводить к высокому уровню NF-kB в КСМЛ-0 и низкому в КСМЛ-100.
Таким образом, работа затрагивает как механизмы посттрансляционной регуляции NF-кВ, так и роль этого транскрипционного фактора в жизнедеятельности клеток. Оба этих вопроса являются ключевыми для современных исследований в области регуляции апоптоза и исследования основных функций и свойств транскрипционного фактора NF-кВ. Кроме того, понимание механизмов регуляции NF-кВ в высоко- (КСМЛ-100) и низко-(КСМЛ-0) метастазирующих клетках может иметь огромнее значение в терапии злокачественных опухолей.
Цель работы
Основной целью данной работы являлось изучение причин поддержапия высокого конститутивного уровня ядерного NF-kB в клетках аденокарцином мыши КСМЛ-0 и КСМЛ-100. При этом ставились задачи искусственного понижения этого уровня и исследовались последствия такового понижения и роль опухолевого супрессора р53 в NF-кВ-зависимом апоптозе.
Научная новизна и практическое значение работы.
В данной работе впервые было продемонстрировано, что в клетках КСМЛ-0 и КСМЛ-100 высокий конститутивный уровень NF-kB поддерживается двумя различными механизмами. В клетках КСМЛ-0 конститутивно активен путь TRAF-2-IKK киназный комплекс, что приводит к короткому времени жизни I-кВа и высокому уровню ядерного NF-kB. При этом ни клетки КСМЛ-0, ни клетки КСМЛ-100 не секретируют в среду агентов, могущих вызывать активацию NF-kB в других клетках. В клетках КСМЛ-100 полноразмерный I-кВа не связывает NF-кВ комплексы, которые, тем не менее, могут быть связаны экзогенным I-кВа. Оба этих механизма уникальны и описаны впервые.
Также впервые на модели аденокарцином продемонстрировано, что понижение уровня ядерного NF-kB в клетках КСМЛ-0 и КСМЛ-100 приводит к гибели этих клеток. Обработка клеток КСМЛ-100 и КСМЛ-0 синтетическими (пирролидип дптиокарбаматом, далее PDTC и №тозил-Ь-фенилаланин хлорметил кетоном, далее ТРСК) и натуральными (I-кВа) ингибиторами NF-kB вызывала в этих клетках алоптоз, в клетках КСМЛ-100 сопровождавшийся быстрым падением уровня транскрипционного факторар53. р53 функционально
активен и уровень белка р53 сравнительно высок в клетках КСМЛ-100. Понижение этого уровня, но не понижение транскрипционной активности р53 также вызывало гибель клеток, что также показано впервые. Все эги данные позволяют говорить о том, что высокий конститутивный уровень NF-kB необходим клеткам аденокарцином мыши КСМЛ-100 и КСМЛ-0 для жизнеспособности и позволяют сделать предположение о новом механизме антиапоптотического действия NF-kB, опосредованного р53.
Результаты, получение в данной работе имеют как теоретическое, так и практическое значение. С одной стороны, они проливают свет иа некоторые ранее неизвестные аспекты регуляции активности как NF-kB, так и р53, внося вклад в целостную картину понимания фундаментальных основ регуляции апоптоза. С другой стороны, получеаые в работе данные могут играть существенную роль при разработке новых подходов в антираковой и противовоспалительной терапии.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 2-м международном семинаре РФФИ (Москва, декабрь 1998), на конференции молодых ученых ИБГ РАН (Москва, февраль 1999), на конференции "Transcription factor pathogenesis of cancer at the millenium" (Dana Point, USA, якварь.2000), на конференции "4-th EMBL transcriptional meeting" (Hiedelberg, Germany, август 2000).
Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает 216 источников Работа проиллюстрирована 13 рисунками.