Введение к работе
Акт^альность_проблемы. Отсутствие значительного прогресса в терапии важнейших вирусных и онкологических заболеваний стимулирует интенсивный поиск новых подходов к борьбе с этими недугами, к числу которых безусловно относится группа комплементарно - адресованных полинуклеотидов, куда входят антисмысловые РНК (асРНК), олигодезоксинуклеотиды и рибозимы. Отсутствие выраженной токсичности, высокая эффективность и специфичность действия, делают их использование крайне привлекательным для направленного ингибирования экспрессии различных вирусных генов и создания на их основе так называемого неприродного информационного противовирусного иммунитета.
Возможности современной генной инженерии позволяют создавать гены асРНК, направленные против практически любого известного вируса, а эффективные промоторные системы способны обеспечивать высокий уровень их экспрессии в зараженных клетках. Вместе с тем, изучение молекулярно-биологических особенностей различных вирусов открывает новые возможности для разработки более надежных и совершенных методов защиты организма от вирусных инфекций. Именно поэтому представляется достаточно актуальным не только создание генов противовирусных асРНК для достижения максимальных и стабильных эффетов ингибирования вирусной репродукции, но и продолжение поиска альтернативных противовирусных агентов, которые бы способствовали избирательного подавлению экспресии вирусных генов и не затрагивали бы экспрессии нормальных клеточных генов.
иели_й_залачи_исследования. Целями настоящей работы являлись поиск оптимальных мишеней в геноме вируса лейкоза коров (ВЛК) для
действия асРНК и промоторных систем для их. эффективной экспрессии, изучение возможностей использования собственного вирусного промотора для контроля транскрипции генов анти-ВЛК асРНК, а также поиск принципиально новых способов ингибирования вирусной инфекции, связанных с утилизацией вирусных трансактиваторных белков. Для этой цели, в частности, планировалось испытание участка промотора U3 области LTR ВЛК в качестве возможного специфического ингибитора транскрипционной активности вирусного промотора в клеточных культурах.
Для достижения выбранных целей, мы разделили работу на три части, при выполнении каждой из которых предстояло решить следующие задачи:
1. Создать серию генно-инженерных конструкций, несущих гены
анти-ВЛК асРНК, направленные на различные функционально значимые
области вирусного генома и находящиеся под контролем промоторов
генов ТК HSV-I, VAI ENA Ad5 и промотора из U3 области LTR ВЛК;
испытать транскрипционную активность выбранных промоторов и
оценить.антивирусное действие полученных генов асРНК в культуре
клеток линии CC8I.
-
Выявить особенности противовирусного действия генов асРНК, контролируемых собственным вирусным промотором.
-
Исследовать возможность использования транскршщионно неактивных энхансерных участков ДНК промотора ВЛК для ингибирования транскрипционной активности вирусного промотора в культуре клеток.
Н2Утаая_новгона_и_етакттеская_значимдсть. В настоящей работе впервые исследовались эффекты противовирусных асРНК, гены которых контролируются собственным вирусным промотором.
Кроме того, впервые показана возможность ингибирования в
культурах клеток как транскрипционной активности вирусного промотора, так и вирусной репродукции, транскритшиошю неактивными двухцепочечными участками ДНК, содержащими области связывания вирусного трансактиваторного белка.
Первая часть работы посвящена созданию серии плазмидннх конструкций с генами анти-ВЛК асРНК, направлешшх против R, R-U5 и 5'-gag областей вирусного генома под контролем трех различных промоторов. В клетках линии CC8I, методом защиты от РНКаз, проведен сравнительный анализ эффективности транскрипции полученных генов асРНК, и установлено, что в данных условиях, наибольшей активностью обладал промотор гена VAI RNA Ad5. Далее был проведен анализ противовирусного действия генов асРНК, на основании чего был сделан вывод, что наиболее эффективной, из всех исследованных, мишенью для действия асРНК в геноме ВЛК является донорный сайт сплайсинга, локализованный в R области вирусного генома. При 5-ти кратном молярном отношении ДНК плазмиды с геном асРНК по отношению к прогеномной вирусной ДНК максимальный ингибирующий эффект составил 99. ,
Во второй части работы было детально исследовано противовирусное действие гена асРНК, находящегося под контролем собственного вирусного промотора из U3 области LTR ВЛК. Оказалось, что ингибирупдий эффект таких асРНК нелинейно зависит от увеличения молярного избытка плазмиды с геном асРНК над прогеномной вирусной ДНК, что свидетельствует о возникновении сопряженной экспрессии вирусных генов и генов асРНК, находящихся под контролем одного и того se промотора.
В третьей части работы оценивалось снижение транскршщионной активности интактного вирусного промотора в присутствие транскрипционно неактивных участков ДНК, содержащих
сайты для связывания вирусного трансактиваторного белка p38tax, и доказан механизм конкуренции, лежащий в основе наблодаемых эффектов.
Работа представляет не только теоретический, но и практический интерес, так как плазмиды с генами асРНК, обладапцими высокой антивирусной активностью могут быть использованы для получения трансгенных животных, устойчивых к вирусу ВЛК, а обнаруженный феномен ингибирования вирусной репродукции участками ДНК, связывающими регуляторные транскрипционные факторы, возможно, станет основой для появления нового класса ингибиторов генной экспрессии, обладающих устойчивой двухспиральной структурой и не требующих транскрипции.
Апробация_рабоЗЇЇ. Результаты работы были доложены и обсуждены на расширенном заседании отдела генной инженерии ВНИИ Сельскохозяйственной биотехнологии и на I Евро-Азиатском Симпозиуме по современным достижениям в биотехнологии (Анкара, октябрь 1995).
_Пї&шациИл По материалам дасссертацни опубликовано 4 печатные работы и одна принята к печати.
Объем и структура диссертации. Диссертационная - работа состоит из: введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего 106 библиографичесских ссылок. Работа изложена на 120 машинописных страницах, включая 2 таблицы и 18 рисунков.