Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ.
Введение 1. Литературный обзор " Технологии ДНК матриц 6
Применение ДНК микрочипов 14
Анализ генной экспрессии 15
Анализ точечного полиморфизма 26
Анализ специфичности ДНК-белкового взаимодействия 37
БелкиНиир50 40
2. Материалы и методы 44
Синтез олигонуклеотидов 44
Производство микрочипов 44
Белок HU 45
Белок р50 45
Условия гибридизации и снятие кривых диссоциации для белка HU.45
Условия гибридизации и снятие кривых диссоциации для белка р50.47
Измерение кривых диссоциации 48
Анализ экспериментальных данных по взаимодействию р50 с
однонитевой и двунитевой ДНК с помощью отношения Фишера 50
SDS гель-электрофорез 52
Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSА) 52
3. Результаты 54
Взаимодействие белков с одно-нитевыми олигонуклеотидами generic микрочипа 54
Специфичность взаимодействия белка HU с одно-нитевыми олигонуклеотидами 57
4 Специфичность взаимодействия белка р50 с одно-нитевыми олигонуклеотидами 58 Взаимодействие белков с двунитевыми олигонуклеотидами generic микрочипа 64
Специфичность взаимодействия белка HU с двунитевыми олигонуклеотидами 66
Специфичность взаимодействия белка р50 с двунитевыми олигонуклеотидами 69
Сопоставление результатов, полученных методом generic микрочипа, с данными экспериментов по gel-shift электрофорезу с использованием двух 24-мерных олигонуклеотидов, каждый из которых содержит 6-мерный участок связывания белка р50 72
Специфичность связывания белка р50 с 4-мерными участками Y бокса 75
4. Обсуждение 77
Выводы 80
Благодарности 81
Список литературы 82
Введение к работе
Биологические и биохимические исследования находятся в периоде нарастающего информационного роста. Использование автоматизированного сиквенирования и вычислительных методов привело к тому, что на сегодняшний день полностью прочитан геном большого числа организмов, в том числе и Homo sapiens. И как результат, огромный перечень генов для каждого из организмов доступен для изучения. Однако простое чтение нуклеотидной последовательности генов не дает информации о том, как эти гены кооперируют в генетических путях, контролирующих физиологию организма. Основной задачей так называемой пост-геномной эры является максимальное использование огромного количества геномной информации для понимания комплексной природы жизни клетки.
Успех проекта сиквенирования генома, который сам по себе явился результатом технологических усовершенствований и инноваций, делает необходимым дальнейшие технологические разработки по эффективному использованию огромного количества информации по сиквенированию. Функциональная геномика ответила развитием ряда новых технологий, и одной из наиболее эффективных стала технология биологических ДНК микрочипов (микроматриц).
ДНК микрочип — это очень точная, с высокой степенью плотности матрица однонитевых олигонуклеотидых образцов, прикрепленных к твердой поверхности. Обычно, ДНК микрочипы изготовлены либо с использованием синтезированных олигонуклеотидов, либо на основе ПЦР-амплифицированных последовательностей кДНК. Таким образом, каждая позиция в решетке микрочипа (ячейка) содержит много копий ДНК определенной последовательности. Использование однонитевой ДНК в таком формате является результатом способности однонитевых нуклеотидных последовательностей с высокой специфичностью гибридизоваться со вторыми нитями, содержащими комплементарные последовательности, и образовывать молекулы двуспиральной ДІЖ. Поэтому в основном ДНК микрочипы используют для анализа комплексных смесей из тысяч нуклотидных последовательностей на присутствие и количество молекул определенной последовательности. Способность качественно и количественно проанализировать смесь нуклеотидных последовательностей делает ДІЖ микрочипы чрезвычайно необходимой технологией с широкой областью применения. На сегодняшний день наиболее часто эта технология используется для анализа генной экспрессии и ДНК полиморфизма.1
Идентификация изменений в генной экспрессии, вызванных определенными воздействиями на организм и/или связанных с изменениями в клетке в результате развития заболевания, долгое время была основной стратегией в исследовании физиологических путей. До недавнего времени анализ генной экспрессии в любом эксперименте был ограничен количественно несколькими десятками генов. Сейчас, с появлением ДНК микрочипов, стало возможным проводить анализ изменения экспрессии десятков тысяч различных генов в одном эксперименте.2 Технология ДНК-микрочипов позволила для определенных типов онкологических заболеваний выделить отдельные группы генов, которые имеют характерный уровень экспрессии, и, таким образом, расширить диагностику раковых заболеваний экспресс ионным анализом.
Вариации в геном ной последовательности и структуре ответственны за большую часть вариаций среди индивидуумов. Знание генетической вариабельности между индивидуумами и корреляция этой информации с фенотипами болезней сыграло важную роль в понимании связи между генами и здоровьем человека.
Помимо указанных основных областей применения, ДНК матрицы используются и для множества других целей. Одна из них основана на способности регуляторных белков взаимодействовать с одно-нитевыми и двунитевыми олигонуклеотидными последовательностями специфичным или неспецифичным образом. Таким образом, ДІЖ матрицы также используют для изучения ДНК-белкового взаимодейсвия.
