Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболеваемость вирусными гепатитами во всем мире стойко сохраняется на высоком уровне. В настоящее время установлено по крайней мере шесть агентов, вызывающих это заболевание. Каждый из гепатитов отличается особенностями течения болезни, тяжестью и характером поражения, способностью к хронизации и возможностью летального исхода.
Вирусы гепатита D (HDV) и Е (HEV) относятся к наименее изученным, но наиболее опасным возбудителям вирусных гепатитов.
Для развития гепатита D необходимо присутствие вируса гепатита в. Инфекционность HDV реализуется в организме в присутствии вируса гепатита В в виде супер- или коинфекции с последним. Клинические проявления дельта-инфекции (ДИ) могут колебаться от фульминантных гепатитов до форм с неявно выраженной симптоматикой. ДИ отличается неблагоприятным прогнозом. Сегодня достоверно установлено, что во многих странах мира ДИ играет важнейшую роль в формировании тяжелых, часто летальных случаев острого и хронического гепатита В, а'также являются причиной значительной доли случаев фульминантного гепатита и цирроза печени. Носительство маркеров ДИ с неявно выраженной симптоматикой представляет опасность заражения донорской крови и ее препаратов.
Гепатит Е (первоначально называемый энтерально передающимся гепатитом ни А ни В) - нозологическая форма вирусных гепатитов, которой обусловлены крупные эпидемические вспышки, охватившие В период с 1986 по 1989 г. до 5% населения среднеазиатских республик. Эпидемиологический анализ выявил взрывной характер вспышек, выраженную осенне-зимнюю сезонность, максимальную поражаемость наиболее активной возрастной группы (15-30 лет) и высокую летальность среди беременных женщин (до 20%). Этим объясняеся необходимость своевременной диагностики с целью блокирования путей дальнейшего распространения вируса-возбудителя.
Таким образом, разработка различных методов диагностики, позволяющих быстро, эффективно распознавать на ранних стадиях различные нозологические формы вирусных гепатитов - остается важной задачей.
В последние годы синтетические пептиды нашли широкое применение в молекулярной биологии, вирусологии и иммунологии. С их помощью стало возможным решение целого комплекса проблем, связанных с исследованием антигенной структуры вирусных белков. Идентификация иммунодоминантных сайтов и синтез пептидов, способных имитировать соответствующие им антигенные участки белков, - путь к созданию новых диагностических и вакцинных препаратов. Анализ структурной организации белковых антигенов способствует пониманию природы взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне.
Цели и задачи исследования. Настоящее исследование посвящено поиску В-эштопов белков HEV и HDV, изучению их структурной организации и развитию подходов к иммуноферментной диагностике и серотипированию HEV и HDV.
В соответствии с целями исследования были сформулированы следующие задачи:
провести анализ гидрофильное и предполагаемой вторичной структуры исследуемых белковых последовательностей;
на основе результатов теоретического прогнозирования и данных литературы осуществить выбор потенциальных антигенноак-тивных участков белков HEV и HDV;
синтезировать выбранные участки белков, их перекрывающиеся и укороченные фрагменты;
провести сравнительное исследование антигенной активности синтетических пептидов в непрямом твердофазном ИФА с серологическим материалом, полученным от пациентов с HEV- или HDV-инфек-цией;
на основе полученных результатов выявить наиболее перспективные в антигенном отношении пептидные фрагменты и осуществить химический синтез генотипических вариантов этих фрагментов;
используя отработанные методы ИФА, определить типы белковых последовательностей HEV и HDV, преобладающих на территории бывшего Советского Союза;
Научная новизна. Осуществлен твердофазный синтез 25 олиго-пептидов с длиной цепи от 9 до 21 аминокислотного остатка (а.о.), представляющих фрагменты белков, кодируемых 0RF1, 0RF2 и 0RF3 генома HEV и белка нуклеокапсида HDV. Из них 24 пептида ра-
- з -нее не были описаны.
Изучена антигенная структура районов, ограниченных а. о. 414-433 белка 0RF2 и а.о. 92-123 белка 0RF3 HEV. Идентифицированы участки, обладающие высокой антигенной активностью.
Исследованы среднеазиатские группы анти-НЕУ-позитивных сывороток с помощью олигопептидов (а. о. 99-119), соответствующих последовательностям белка 0RF3 бирманского и мексиканского изо-лятов HEV и установлены значительные отличия в антигенной активности этих пептидов.
Впервые проведен сравнительный иммуноферментный анализ сывороток крови больных ГД из двух районов РФ на основе пептидов, относящихся к трем различным генотипическим вариантам HDV и установлены белковые последовательности, наиболее характерные для HDV, распространенного на территории нашей страны.
Практическая значимость работы. Получены пептидные антигены - фрагменты белков HEV и HDV, рекомендованные для создания пептидных иммуноферментных диагностических тест-систем для определения в крови антител к HEV и HDV.
Установлен изолят HEV, антигенная структура которого на участке а.о. 99-119 белка 0RF3, наиболее близка среднеазиатским вариантам этого вируса.
с помощью групп анти-НОУ-позитивных сывороток и набора синтетических пептидов из состава иммунодоминантного участка а. о. 65-80 участка, выявлены два наиболее вероятных типа HDV, циркулирующих на территории России.
Пептидный фрагмент а.о. 99-119 из состава белка, кодируемого 0RF3 генома бирманского изолята HEV, послужил позитивным контролем на начальных этапах создания отечественной диагностической тест-системы на анти-HEV на основе рекомбинантного антигена.
Использованные в данной работе подходы к исследованию структурно-функциональной организации иммунодоминантных эгштопов белков HEV и HDV могут быть применены для изучения вероятной антигенной структуры других вирусных белков.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Стратегия химического синтеза и иммунологического исследования антигенных свойств 25 олигопептидов с длиной пептидной цепи от 9 до 21 а.о. из состава белков вирусов гепатита D и Е;
-
Принципы отбора антигенов для иммуноферментной диагностики и серотипирования на основе антигенноактивных олигопептидов
из состава белков 0RF2 и 0RF3 HEV и белка нуклеокапсида HDV;
-
Антигенная структура иммунодоминантного участка а.о. 99-119 0RF3 белка среднеазиатских вариантов HEV ближе к структуре изолята HEV из Бирмы, чем из Мексики;
-
Антигенная структура фрагмента а.о. 65-80 белка нуклеокапсида HDV, имеющего распространение на территории России, соответствует последовательности генотипов I и II HDV.
Публикации. По результатам проделанной работы опубликованы 3 статьи и тезисы 4 докладов.
Апробация работы. Результаты работы представлены на международном Фальк симпозиуме No 92 "Новые направления в гепатоло-гии" в г. Санкт-Петербурге (1996 г.), на VII съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в г. Москве (1997 г.), на V Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" в г. Санкт-Петербурге (1997 г.) и на II Российской научно-практической конференции с международным участием "Гепатиты Б, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики" в г. Москве (1997г.). Результаты работы доложены и обсуждены на совместной Конференции Отдела молекулярной вирусологии и Совета по предварительной экспертизе диссертаций НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 30 октября 1997 г.
Объем и структура работы. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем диссертационной работы составляет 165 стр. машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 8 таблицами, 19 рисунками и 13 схемами. Список литературы включает 236 наименований на русском и английском языках.