Введение к работе
Актуальность проблемы. Бурное развитие молекулярной биологии за последние 10-15 лет в значительной мере обусловлено эткрытием рестрикционных эндонуклеаз. Эти ферменты широко используются для конструирования рекомбинантных молекул, физического картирования и секвенирования ДНК. Во многих научных лабораториях и коммерческих фирмах проводится целенаправленный поиск новых рестриктаз. В последние годы отклонировано несколько' десятков генов рестрикционных систем, главным образом силами фирм-производителей продуктов для генной инженерии. Это приводит к тому, что с каждым годом все большее количество рестриктаз становится доступным для исследователей.
Помимо прикладной значимости, рестрикционные эндонуклеазы и метилазы интересны как модельные объекты при изучении ДНК-белкового взаимодействия из-за своего небольшого размера и высокой специфичности узнавания нуклеотидвых последовательностей, а также ввиду отсутствия каких-либо регуляторних механизмов, модулирующих ферментативну» активность и усложняющих исследование многих других ферментов, работающих на ДНК.
Однако, несмотря на большое значение рестриктаз и метилаэ для науки и практики, кинетика и механизм их действия изучены крайне недостаточно. Известно, например, что все или большинство сайт-специфических эндонуклеаз расщепляют различные сайты узнавания с разной скоростью, но до сих пор неясно, какие детерминанты на ДНК определяют эффективность расщепления того или иного сайта, и изменением какого кинетического параметра реакции обусловлена разная скорость ее протекания. Тем более открыт вопрос о возможной биологической роли подобной избирательности рестриктаз.
Много лет назад было показано, что некоторые рестриктазы разрезают ДІЖ путем последовательного внесения кинетически независимых однонитевых разрывов, т.е. по двухударному механизму, в то время как другие гидролизуют обе нити без диссоциации с ДНК (по одноударному механизму). Пока остается невияснешшм, чем
обусловлен механизм расщепления ДНК в каждом конкретном случ< и играет ли какую-нибудь роль в его определении нуклеотиді последовательность сайта узнавания. Непонятно также, поч< некоторые ферменты в разных условиях или на различных субстра' реализуют разные механизмы реакции.
Изучение кинетики рестрикционных эндонуклеаз и мети, важно для понимания общих принципов ДНК-белкового взаимодейсті и существенно расширяет возможности использования этих фермен' в практике генной инженерии.
Цель работы. В настоящей работе мы ставили целью изучеі ряда кинетических характеристик взаимодействия изошизомері рестриктаз BspRI, Pall и НаеІІІ, а также метилазы BspRI, с Д1 В частности, предполагалось:
1. Измерить относительные скорости расщепления (или мети.
рования) ряда сайтов вышеуказанными ферментами и выявить закої
мерности, определяющие эффективность использования каждого cai
в качестве субстрата реакции.
-
Выяснить, по какому механизму, одно- или двухударної работают рестриктазы BspRI, Pall и НаеІІІ.
-
Изучить влияние метилирования внешнего цитозина са; узнавания (GGCC) на эффективность его расщепления рестриктазаі
Научная новизна и практическая ценность работы. Провед сравнительное изучение кинетики нескольких изошизомерных ре1 риктаз. Обнаружено, что рестриктазы BspRI, Pall и НаеІІІ про ляют сходство по ряду признаков: с наибольшей эффективное расщепляют одни и те же сайты, работают по двухударному механ му. Метилирование внешнего цитозина сайта узнавания (GGCC) с. жает скорость его расщепления рестриктазами Pall и НаеІІІ, но BspRI. Выявлены особенности нуклеотидной последовательное позволяющие предсказывать эффективность расщепления сай BspRI. Измерены относительные скорости модификации различ сайтов рестрикционной метилазой BspRI. Показано, что метилаз наибольшей эффективностью модифицирует сайты, плохо расщепляе парной рестриктазой, и наоборот. Это позволяет предположить I ществование альтернативной биологической функции рестрикцію}
темы BspRI.
В настоящей работе впервые проведено подробное сравнение іетических характеристик нескольких изошизомерных ферментов, івлеїш особенности, позволяющие предсказывать эффективность :щепления сайта рестриктазой, измерены скорости модификации іличішх сайтов метилазой.
Получение результаты позволяют расширить возможности прак-геского использования изучавшихся ферментов, в частности в :периментах с использованием недорестрикции и при работе с гилированной ДНК.
ШЁОбш^я^абдш. Материалы диссертации были доложены на I учной конференции молодых ученых ВНИЙТенетика (Москва, 1986), II Международной школе-конференции молодых ученых социалис-ческих стран "Молекулярные основы биотехнологии" (Пущино, 87) и на I рабочем совещании по ферментам рестрикции-моднфика-и (Пущино, 1989)
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 науч-ю работы.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, ітирех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, ісуждеіше) и выводов. Работа изложена на 107 страницах малншо-існого текста, включающих И рисунков, 13 таблиц и список цити-)ванной литературы (145 наименований).