Введение к работе
Актуальность темы. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы являются
ферментами, ответственными за синтез ДНК в живых клетках! К насто- '
ящему.временй ДНК-полимеразы выделены из многих видов организмов
от вирусов до человека. Однако, несмотря на значительный прогресс в
, изучении этих ферментов, информация об их свойствах, роли в процессе
синтеза ДНК достаточно противоречива. Это определяется в первую оче-
, редь сложностью строения ферментов, трудоемкостью их очистки и разно
образием их функций. До недавнего времени считалось, что основной рс-
пликативной ДНК-полимеразой у эукариот является ДНК-полимераза а.
Только в последние.годы стало очевидно, что а репликации ДНК у эука
риот принимают участие ешедве ДНК-полимеразы: ДНК-полимераза б и
ДНК-полимераза е. В последние годы значительные усилия исследовате
лей были направлены да очистку и характеризацию этих ферментов.
Однако до сих пор отсутствует метод выделения гомогенного препарата
ДНК-полимеразы с из плаценты человека, весьма ограничены сведения о
субстратной специфичности фермента, изучение которой позволит прово
дить направленный синтез ингибиторов репликации ДНК с участием
ДНК-полимеразы е. .
Цель и задача исследования. Основной задачей исследования была разработка метода.выделения ДНК-полимерззы є из плаценты человека, изучение субстратных свойств ДНК-полимеразы в с помощью аналогов нуклеозид 5'-трифосфатов, модифицированных до фуранозному кольцу и трифосфатной группе! Эта работа проводилась в плане исследований Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток по сравнительному исследованию ДНК-полимераз из разных источников и механизмов катализа синтеза ДНК с помощью субстратных ингибиторов.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые разработан метод быстрого выделения гомогенного препарата ДНК-полимеразы s нэ плаценты человека. Метод позволяет параллельно получать высокоактивный препарат ДНК-полимеразы а. Изучение физико-химических свойств полученной ДНК-полимеразы е показало, что онз состояла из одной субъединицы с молекулярной массой 170 кД,я. Впервые проведен систематический ингибиторный анализ синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимсразой е с помощью аналогов нуклеочид 5*-трифос-фатов, модифицированных по фуранозному кольцу и трифосфатной груп-
пе.'Показано, что ДНК-полимерзза є имеет.высокую субстратную специ
фичность. Из испытанных соединений субстратами ДНК-полимеразы є
были только три вида аналогов нуклеозид З'-трифо'сфатов; З'-амино-
2',3'-дидезокситнмидин-5*-трифосфат(сісГГГР(3'НН2), 1-((5-0-арабиио-
фуранцдил)-цитозин-5'-трифосфат (агаСТР) и ациклические аналоги 0-4'-
цор-2*,3'-дидезокси-2',3'-дидегидронукяеозид-5'-трифосфаты (acyclo-
4NTP). Все они включались в рэстущую цель ДНК н терминировали
синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой е. Найдены различия в
субстратной специфичности между ДНК-полимеразойе и другими ДНК-
Іірлимеразамн эукариот, а также обратными транскраптазами. :
ретровирусоь. -
Объем работы. Диссертация изложена на (27 страницах, включая і2 рисунков, ^ таблиц и список цитированной литературы (\%9 ссылок), работа состоит из введении, четырех глав и выводов. Глава I - Обзор литературы, Глава 2 - Материалы и методы, Глава 3 - Обсуждение и результаты. Глава 4 - Заключение.
Публикации и апробации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ и еще I находится в печати.. Результаты работы догладывались на Международном симпозиуме "Синтетические олигону-ріеотидьі: проблемы и перспективы практического применения" (1991, Москва), на Международной конференции "Модекулярно-биологнческие аспекты диагностики и терапии СПИДа (1991, Новосибирск), на 17-м Международном конгрессе по химиотерапии (1991, Берлин), на 8-м Сре-диземноморском конгрессе по химиотерапии (1992, Афины), на Международной конференции "Молекулярная биология репликации ДНК" . (1992, Веггпс-Швейцария).,