Введение к работе
Актуальность темы. ДНК-зависимая РНК-полимераза Escherichia coli -сложный многосубъедииичнын фермент, осуществляющий транскрипцию генов бактерии. Наши знания о функциональной роли различных участков субъедшшц РНК-полимеразы ограничены. Применение прямых структурных методов затруднено сложным строением и большими размерами РНК-полимеразы. Кристаллы РНК-полимеразы, пригодные для рентгеноструктурного анализа, получить не удается, а методы нейтронного рассеивания и электронно!'! микроскопии дали лишь общую форму фермента (Darsl ее аК, 1989).
Молекулярно-генетнческиіі подход к изучению структуры и функции РНК-полимеразы состоит в получении мутаций в генах, кодирующих субъединицы фермента, и изучении свойств мутантных ферментов in vivo и in vitro. Систематическое применение такого подхода позволит соотнести известные изменения в первичной последовательности субъединиц с функциональными дефектами мутантных ферментов. Это даст возможность построения моделей механизмов действия и регуляции РНК-полимеразы. Настоящая работа посвящена применению такого подхода к р-субъединице РНК-полимеразы.
Цель работы и задачи исследования. Целью работы было построение структурно-функциональной модели Р-субъединнцы в составе РНК-полимеразы. В работе ставились следующие задачи: (і) изучить взаимоотношение между мутациями устойчивости к рифамшщнну и стрептолнднпшу в гене граВ, кодирующем Р-субъедннпцу РНК-полимеразы; (іі) изучить роль протяженных эволющюнно вариабельных районов Р-субъединнцы.
Научная новизна и практическая ценность работы. Получено большое количество новых RifR и Stl^ мутаций в гене гроВ. С помощью делеционно-инсерционного мутагенеза гроВ определен участок р-субъединнцы, ответственный за взаимодействие со стрептолидигином;
покачано, что этот участок находится на поверхности РНК-полимеразы. Установлено, что более 25% последовательности р-субъединицы несущественны ни для сборки, ни для активности РНК-полнмсразы in vitro. Получены данные, которые свидетельствуют о наличии двух независимых доменов в Р-субъединице. Определен участок (э-субьединицы, ответственный за взаимодействие с фактором термннации транскрипции Ліс.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов п их обсуждения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста и содержит 21 рисунка и 1 таблицу. Библиография включает в себя 154 названии, в том числе 6 русских и 148 иностранных.