Введение к работе
Актуальность проблемы: В период с 1987 по 1991 годы рядом исследователей была сформулирована концепция искусственного информационного иммунитета на основе комплементарю адресовашшх нуклеотидных последовательностей (КАП). Ровдение идеи было вызвано потребность» найти как можно более "прицельный" способ влияния на экспрессию генов в клетке. Цуклеотидная последовательность генов, в частности, имевдих определяющее значение в возникновении заболеваний: наследственных, онкогенных, «чрусной природы, других - является абсолютно индивидуальной. Введя в пораженную клетку последовательность, комплементарную гену - "возбудителю" (т.н. антпсмысловую), можно рассчитывать на комплементарное исключение гена из процессов, приводящих к заболеванию. Основанием для появления концепции явились накопленные к этому времени в значительном количестве научные данные, доказыващие явление регуляции по антисмысловому механизму природных и искусственных генов. В частности неоднократно была описана способность КАП подавлять вирусную репликацию в культуре тканей животных.
В тот еє период и в настоящее время успешно развивается технология получения пород трансгенных сельскохозяйственных (с/х) 2ПВОТШХ с полезными для человека. признаками. Породы таких пшотных сегодня получены п интенсивно изучаются. Сегодня это направление укз мояно рассматривать как альтернативу многовековой селекции С/Х ЕИВОТНЫХ.
Одной из важнейших проблем, стояззх перед селекционерами, всегда являлось выведение пород с/х гпвотных, устойчивых к заболеваниям. Серьезной проблемой гнвотноводства во многих
странах мира, включая России, продолжает оставаться лейкоз крупного рогатого скота. Возбудителем заболевания является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЖ). Заболевание в терминальной стадии характеризуется анемией, потерей веса, снижением продуктивности, другими экономически важными признаками и, как правило, заканчивается гибелью животного. В начале 90-х годов в России этим вирусом было заражено до 70% коров. На фоне экономического кризиса вполне правомочно предполагать, что зараженность животных гораздо выше 70-ти %.
Не говоря уже об экономической целесообразности работ, направленных на получение пород трансгенных с/х животных, устойчивых к заражению ВЛК, хотелось бы обратить внимание на тог факт, что в контакт с этим вирусом вступает и человек. К примеру, в непастеризованном молоке вирус может сохраняться до трех суток. Широко распространен контакт "кровь-кровь" при переработке мяса, ветеринарных операциях, при непромышленном получении молока и т.д. Хотя на сегодняшний день и не показана возможность заражения человека ВЖ, нельзя оставить без внимания доказанную способность ВЖ заражать не только животных, относящихся к одному с коровами семейству, но и животных другого семейства и даже отряда млекопитавдих (кролики, крысы, морские свинки и др.). Вирус способен проникать в экспериментах in vitro в клетки кошек, собак, человека, репродуцироваться и персистировать в них. Наконец, следует всегда помнить о возможности мутационных изменений в геноме ВЛК, могущих существенно расширить' его инфекционный потенциал в отношении человека. Эти данные в совокупности с данными о сходстве "стратегии" генома ретровирусов человека и животных, а иногда значительной гомологией части их геномов, заставляют задуматься об опасности слишком близкого
"соседства" ВЛК и человека. Таким образом, с нашей точки зрения, может оказаться, что проблема имеет еще и медицинское значение.
Цели и задачи исследования: Настоящая работа является исследовательским этапом программы, направленной на получение пород крупного рогатого скота, устойчивых к заражению ВЛК по антисмысловому механизму.
В связи с большим периодом вынашивания плода и малым количеством животных в помете, получение трансгешшх коров является длительным и дорогостоящим мероприятием, требушим, следовательно, серьезной научной обоснованности. Поэтому в качестве модели для первого этапа исследований были выбраны кролики, продолжительность исследований на которых значительно короче, и главное - на которых ранее показана персистениия ВЛК и вызываемые этим вирусом симптомы иммунодефицита, по которым в свою очередь можно было бы наблюдать влияние КАП на заболевание. Получение линий трансгенных кроликов, устойчивых по антисмысловому механизму к заражению ВЛК, и являлось главной целью настоящей работы.
В задачи исследования таким образом входило: I - методом мшфоинъекции ввести анти ВЛК асРНК ген в яйцеклетки кроликов и среди родившихся животных отобрать тех, в геном которых произошла интеграция гена, 2 - физически охарактеризовать особенности интеграции грансгена в хромосому каздого животного, 3 - изучить особенности наследования трансгенов у разных животных, 4 -показать наличие экспрессии асРНК в лимфоцитах шівотннх, 5 -тмунолопмзскими и гематологическими методами охарактеризовать особенности ответа организма трансгенных ангиВЛК кроликов на заражение ВЛК, б - изучить влияние асРНК гена на особошости
течения заболевания у трансгешшх животных.
Научная новизна и практическая значимость: В работе впервые описано получение линий трансгеншх с/х животных с антиВЖ асРНК геном. Впервые на уровне организма с/х животного удалось показать ингибиругщее влияние КАП на инфекцию ВПК.
Апробация работы: Результаты работы были доложены и обсуждены на расширенном заседании отдела генной инженерии ВНИИ Сельскохозяйственной Биотехнологии и на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, зошотноводстве и ветеринарии", ВНИИСБ, Москва 1996.
Обьем п структура диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, вклгчапзего 159 библиографических ссылок. Работа изложена на 105 машинописных страницах вклшая 7 таблиц и 13 рисунков.