Содержание к диссертации
Список сокращений 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
T.I. Флуоресцентный белок avGFP и его свойства 7
Аминокислотные замены, влияющие на экспрессию avGFP 12
avGFP дикого типа и другие его варианты с 13 протонированным хромофором
Варианты avGFP с анионным хромофором 17
Варианты avGFP с флуоресценцией в синей и голубой 18 областях спектра
Варианты avGFP с флуоресценцией в желтой области 21 спектра
T.1.6.Фотоконверсия GFP в бескислородных условиях 24
I.II Флуоресцентные белки с хромофором, отличающимся от GFP 27
I.II.1. Красный флуоресцентный белок DsRed и его варианты 28
І.П.2. Флуоресцентные белки с DsRed-подобным 34
предшественником хромофора.
1.11.3 Красный фотоактивируемый флуоресцентный белок Kaede 37
1.1 II. Функциональное значение, эволюция и разнообразие GFP- 39
подобных белков
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 45
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
П. 1. Материалы и оборудование 46
П.2. Методы исследования 50
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III.I. Получение варианта avGFP с флуоресценцией в красной 58
области спектра
III.I.1. Варианты avGFP-S65H и avGFP-S65H/V68N 59
Случайный мутагенез вариантов avGFP-S65H и avGFP- 60 S65H-V68N
Характеристика вариантов avGFP CR1, CR2, CR3, CR4 61
Получение варианта avGFP с пиком эмиссии 63 флуоресценции в красной области спектра
Случайный мутагенез R5-1 с отбором по времени 65 появления и интенсивности красной флуоресценции. Варианты R6-31 иЮ0-3..
Ш.П. Вариант R10-3 и его свойства
III.II. 1. Спектральные свойства R10-3 66
III.И.2. рН-зависимость флуоресценции варианта R10-3 68
Ш.П.З. Температурная зависимость и кинетика функционального 69
созревания R10-3
III.II.4. Использование R10-3 в качестве двухцветной метки 70
III.П.5. Анализ аминокислотных замен в варианте R10-3 73
III.II.6. Предлагаемый механизм образования хромофора в 74
варианте R10-3
Ш.П.7. Эффективность образования хромофора с красной 78
флуоресценцией в полученных вариантах avGFP
Ш.Ш.Исследование фотоконверсии GFP в анаэробных условиях
Ш.Ш. 1. Спектральные свойства фотоконвертированной формы 79
EGFP.
Ш.Ш.2. Исследование способности различных флуоресцентных 82 белков к фотоконверсии в бескислородных условиях III.П.2. Исследование фотоконверсии флуоресцентных белков в 84 присутствии дитионита натрия
Ш.П.4. Анализ аминокислотных последовательностей 87
флуоресцентных белков, способных к фотоконверсии в
бескислородных условиях
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 90
ВЫВОДЫ 92
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 93
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
aceGFP - улучшенный зеленый флуоресцентный белок медузы Aequorea
coerulescence amFP486 - голубой флуоресцентный белок морского анемона Anemonia majano ECFP - enhanced cyan fluorescent protein (улучшенный голубой флуоресцентный
белок) EGFP - enhanced green fluorescent protein (улучшенный зеленый
флуоресцентный белок) EYFP - enhanced yellow fluorescent protein (улучшенный желтый
флуоресцентный белок) ESPT - excited-state proton transfer (перенос протона в возбужденном состоянии
хромофора) FITC фильтр - стандартный светофильтр для красителя флуоресцеин
изотиоцианат (возбуждение 460-490 нм, эмиссия от 510 нм) FP - fluorescent protein (флуоресцентный белок) GFP - green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок) медузы
Aequorea victoria ppluGFP2 - зеленый флуоресцентный белок копеподы Pontellina plumata zFP506 - зеленый флуоресцентный белок кораллового полипа Zoanthus. а.о. - аминокислотный остаток дНТФ -2'-дезоксинуклеозид-5 '-трифосфат ИПТГ - изопропил-/3-0-тиогалактопиранозид нт - нуклеотид
н.п. - пара нуклеотидов (в составе ДРПС или РНК) ПЦР - полимеразная цепная реакция Трис - Трис(гидроксиметил) аминометан ФАФБ - фотоактивируемый флуоресцентный белок. ЭДТА - этилендиаминтетраацетат Ф - квантовый выход флуоресценции е - молярный коэффициент экстинкции у.е. - условные единицы
Введение к работе
Первый представитель семейства GFP-подобных белков - avGFP - был выделен из гидромедузы Aequorea victoria [140, 100]. Однако качественный скачок в исследовании флуоресцентных белков наступил много позднее, после 1992 года, когда удалось клонировать этот ген [82]. С этого момента интерес к флуоресцентным белкам не ослабевает. Отличительным, и наиболее важным для практического использования свойством avGFP и других известных GFP-подобных белков является способность к формированию хромофора вне зависимости от внешних ферментативных активностей, субстратов или вспомогательных кофакторов, за исключением молекулярного кислорода [44, ПО]. Известно, что ген GFP содержит всю необходимую информацию для формирования функционально активного белка [56], что и определяет основную область применения флуоресцентных белков - в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки.
Менее 10 лет назад GFP-подобные белки были обнаружены в коралловых полипах класса Anthozoa, в том числе впервые - природные желтые и красные флуоресцентные белки [63], а также нефлуоресцентные хромобелки [58]. Представления о филогенетическом разнообразии флуоресцентных белков значительно расширились после их обнаружения в представителях ракообразных Copepoda (тип Членистоногие) [96], а недавно - в ланцетниках (тип Хородовые) [25] Цветовой диапазон известных в настоящее время флуоресцентных белков, как природных, так и созданных искусственно, перекрывает почти всю видимую область спектра, от синего до дальне-красного [19,72,99]
В тоже время, для различных представителей флуоресцентных белков характерны индивидуальные особенности и ограничения при проведении реальных экспериментов, среди которых существенны олигомерное состояние, рН-зависимый характер флуоресценции, склонность к агрегации и т.д, что затрудняет трактовку результатов, полученных с использованием различных флуоресцентных белков. До сих пор актуальной остается задача получения новых спектральных вариантов наиболее широко используемого флуоресцентного белка avGFP. Особый научно-практический интерес представляет возможность создания флуоресцентных белков на основе avGFP с флуоресценцией в красной области спектра, получить которые до сих пор не
удалось, ни смотря на более чем 15-летнюю историю его мутагенеза и множество накопленных данных о структурно-химических основах флуоресценции природных красных флуоресцентных белков.
При этом единственное описанное состояние avGFP, в котором этот белок проявляет способность к красной флуоресценции, - при фотоактивации под действием интенсивного облучения синим светом в условиях пониженного содержания кислорода [28, 93], - остается практически не изученным и нашло только ограниченное применение в экспериментах с анаэробными организмами. До настоящего времени не найдено объяснения необычному характеру спектра эмиссии флуоресценции avGFP при такой фотоактивации, чувствительности процесса к содержанию кислорода, и не предложено гипотез, объясняющих механизм данного явления.
Целью данной работы стало получение вариантов avGFP, способных к флуоресценции в красной области спектра, с применением современных данных о механизме образования хромофоров красных флуоресцентных белков, и исследование фотоконверсии avGFP и некоторых других ФБ в бескислородных условиях.
Похожие диссертации на Формы зеленого флуоресцентного белка Aequorea Victoria, флуоресцирующие в красной области спектра
