Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
отдал іссертацин
эяиая работа посвящена изучению генов ДНК-лигаз Т-четных бактериофагов. ДНК-лигаза - ключевой фермент репликации, рекомбинации и репарации. За прошедшие со времени открытия этого фермента два десятилетия интерес к нему у исследователей не ослабевает. Дополнительная необходимость исследования и клонирования генов этих ферментов вытекает из очень широкого применения ДНК-лигазы фага Т4 в экспериментах по генетической инженерии и синтезу генов.
Изучение связи структуры и функции фермента в настоящее время требует определения нуклеотидной последовательности его гена и может быть сильно облегчено дополнительным анализом гомологичного гена и его продукта. Исследование генов ДНК-лигаз фагов Т4 и Тб, а также создание систем суперпродукции ДНК-лигазы фага Тб является необходимым этапом структурно-функционального анализа фермента и направлено как на решение эволюционных и молекулярно-биологических вопросов, так и на обеспечение практики генно-инженерных работ.
Цель настоящей работы заключалась в сравнительном исследовании генов ДНК-лигаз Т-четных бактериофагов и в создании штаммов-продуцентов ДНК-лигазы фага Тб методами генной инженерии. В задачу исследования входило клонирование гена ДНК-лигазы фага Т4 в плазмиду, оптимизация методов гидролиза оксиметилцитозинсодержащеи ДНК Т-четных фагов эндо-нуклеазами рестрикции, клонирование гена ДНК-лигазы фага Тб из такой сложномодифицированной ДНК, определение полных первичных структур данных генов, выявление степени гомологии ДНК-лигаз и их генов с помощью сравнительного анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей и получение мтамма-суперпродуцента ДНК-лигазы фага Тб.
Основная часть,работы посвящена новому этапу в исследовании Т-четных бактериофагов - сравнительному изучению отдельных генов. В настоящей работе впервые был клонирован ген ДНК-лигазы фага Тб. Для клонирования данного гена были исследованы и оптимизированы условия гидролиза оксиметилцитозинсодержащеи ДНК фага Тб. Ген ДНК-лигазы фага Т4 был впервые клонирован в составе плазмидного вектора.
Впервые определены нуклеотидные последовательности генов ДНК-лигаз
бактериофагов Т4 и Т6. Выведены полные первичные структуры этих ферментов, состоящих из 487 аминокислот. Проведенный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов ДНК-лигаз фагов Т4 и Тб выявил их большую гомологию. В генах имеется 41 нуклеотидная замена, а в ферментах - 6 аминокислотных взаимных замен. Все аминокислотные замены локализованы в центральной части последовательности. Обнаружено специфическое расположение замен в сравниваемых генах. Показана высокая консервативность регуляторных областей, но обнаружено различие в структуре перекрытия гена ДНК-лигазы с предшествующей ему открытой рамкой трансляции.
Исследование экспрессии гена 30 фага Тб под контролем промотора лактозного оперона кишечной палочки и под контролем левого промотора бактериофага лямбда были проведены впервые и позволили создать штаммы-суперпродуценты ДНК-лигазы фага Тб.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Полученные в диссертационной работе данные расширяют современные представления о структурной организации и молекулярной эволюции ключевого фермента генетических процессов - ДНК-лигазы. Результаты настоящей работы, а также сконструированные плазмиды и штаммы представляют несомненный практический интерес, так как разработанные в диссертации подходы могут быть использованы для клонирования любых гомологичных генов Т-четных бактериофагов с последующим получением штаммов-суперпродуцентов различных белков. С этой точки зрения представляет научный и практический интерес клонирование любых других гомологичных генов и исследование других белков Т-четных бактериофагов. Примером применения в практике молекулярно-биологических экспериментов гомологичных белков могут служить РНК-полимеразы фагов ТЗ и Т7, широко использующиеся для промоторспецифичного синтеза мРНК. Успешное использование для клонирования модифицированной (оксиметилцитозинсодержашей) ДНК фага Тб открывает пути клонирования любых мутантных генов Т-четных бактериофагов, что расширяет возможности для генетического и молекулярно-бисшогическо-го анализа на таком удобном об'єкте как фаг Т4.
Штаммы-суперпродуценты ДНК-лигазы фага Тб могут быть использованы не только для наработки этого фермента, но и для исследования регуляции экспрессии генов, для исследования роли этого фермента в развитии и эволюции фага. Можно считать, что в данной работе создана база для исследования ДНК-лигаз методами белковой инженерии. 2
Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Генетическая инженерия" (Пущино,Т980), на 6-ом двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубо,'1'982), на Всесоюзной конференции "Метаболитические плазмиды бактерий" (Таллин,t982), на 3-ем двустороннем симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Siena,1983), на Всесоюзной конференции "Вирусы микроорганизмов и растений"(Ташкент,Т986), на Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Пумино, 1986).
Основное содержание диссертации отражено в 8 опубликованных работах.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ