Введение к работе
Одной из главных проблем современной молекулярной и клеточной
биологии является раскрытие механизмов регуляции развития и
функционирования клеточных систем эукариот. Все модели для их
изучения создаются и используются с целью познания механизмов
регуляции нормального и патологического роста и развития клеточных
популяций животных и человека. Однако, несмотря на многочисленные
Экспериментальные . данные и большое число предложенных
теоретических разработок эта проблема до сих пор далека от
разрешения. Важнейшим звеном в ее решении является изучение
внутриклеточных, популяционных и системных механизмов регуляции
двух фундаментальных процессов - пролиферации и
цитодифференцировки, соотношение которых изменяется в ходе развития и функционирования каждой клеточной популяции и определяется деятельностью генетического аппарата клеток и регуляцией его активности. Поэтому особо важное место в этих исследованиях занимает изучение количественных и структурных изменений ДНК в ядрах клеток, значение этих изменений в осуществлении процесса цитодифференцировки, их взаимосвязи с терминальной специализацией и, в конечном итоге, реализации программы развития клеточных популяций в целом.
Исследуя характер изменений в количестве ДНК, степени выраженности этого явления в клетках и его роли, места и значения при развитии всех известных типов клеточных популяций - растущих, обновляющихся и долгоживущих, Ю.. А. Магакяном была выдвинута, а затем биологически и математически обоснована концепция, согласно которой в нормальных условиях развития популяций при необходимое ускорения процессов цитодифференцировки и интенсификации тканеспецифических синтезов включаются резервные механизмы активации генома в виде дополнительного синтеза ДНК, названного "гиперрепликацией" ДНК (Магакян, 1990). В этих же исследованиях было показано, что гиперрепликация ДНК, будучи средством повышения надежности генетического аппарата клетки и адаптации к внешним условиям, может быть закреплена в эволюции вида и входить в программу нормального развития различных клеточных систем. Было показано также, что клетками, в зависимости от ситуации, могут быть использованы различные способы умножения своего генома в целом и отдельных его участков или блоков (полиплоидия, политения и амплификация генов).
Между тем значительный интерес представлял также вопрос о роли, месте и значении "гиперрепликации ДНК при восстановлении клеточных популяций в экстремальных условиях и патологии, так как обдкзизвестно, что в основе восстановления поврежденных органов и тканей лежат такие фундаментальные процессы, как размножение и гипертрофия клеток, причем доля участия их при регенерации разных органов неодинакова. В центре внимания при исследовании процессов регенерации всегда стояли три основных вопроса: каким образом реализуется процесс регенерации, каковы внутриклеточные и надклеточные источники восстановления и как регулируются
регенерационные процессы. Исходя из этого, было естественным проведение исследований характера функционирования различных клеточных систем при разного рода патологиях и в экстремальных условиях, выделяя в качестве главной задачи анализ проявлений и роли гиперрепликации ДНК, индукция запуска механизмов которой, представлялась вполне вероятной в этих условиях. Учитывая то, что между процессами регенерации и эмбриональным развитием органов и тканей наблюдается определенное сходство, а также то, что гиперрепликация ДНК нередко входит в программу развития эмбриональных популяций в норме, представлялось интересным проведение сравнительного анализа проявлений гиперрепликации ДНК в аналогичных эмбриональных и регенерирующих клеточных системах. При этом мы исходили из положения о том, что в основе регуляции размножения, дифференцировки, специализации и жизнедеятельности клеток в целом лежит, во первых, регламентация со стороны генома клетки и суммарного генома популяции и, во вторых, возможность реализации генетически обусловленных потенций к сохранению жизнеспособности в изменившейся ситуации.
Важное место в наших исследованиях заняло также изучение влияния биологически активных веществ на восстановительные процессы при различных патологиях и в экстремальных условиях и проявлений гиперрепликации ДНК при этом.
В качестве модели при исследованиях стабильных клеточных популяций были аыбраны паренхиматозные органы, в частности, печень и поджелудочная железа, в программу нормального развития которых входит гиперрепликация ДНК путем их полиплоидизации и образования двуядерных клеток. Она наблюдается в постнатальном развитии крыс и носит необратимый характер, поэтому в этих исследованиях изучалась не инициация процесса гиперрелликации ДНК при патологии, а степень выраженности этого явления под влиянием повреждающих факторов. Этим и обусловлен интерес к изучению жизнедеятельности панкреацитов и гепатоцитов в патологии и к выяснению взаимозависимостей между внутриклеточными и популяционнымм системами регуляции, определяющими характер функционирования механизмов гиперрепликации ДНК, степени ее выраженности в норме и патологии и вклада в процесс самосохранения популяции.
Интересно было также выяснить имеет ли место индуцированная .гиперрепликация ДНК, в той или иной форме своего проявления в популяциях, где в нормальных условиях все клетки диплоидны. К таким популяциям относятся непрерывно обновляющиеся во взрослом организме популяции, например гемопоэтическая популяция, среди клеток которой согласно литературных данным, лишь у мегакариоцитов сильно выраженная полиплоидия входит в программу дифференцировки при нормальном тромбопоэзе (Garcia, 1964, Westte, Penington, 1972, Abramov 1985). Поэтому нами и было предпринято исследование поведения клеток моноцитопоэтической и эритротюэтической линий в аспекте проблемы гиперрелликации ДНК в патологии и в экстремальных условиях И влияния биологически активных "веществ на процесс' цитодифференцировки в этих условиях.
Целью работы явилось исследование изменений возникающих в системах регуляции размножения и функционирования клеточных популяций в экстремальных условиях, при экспериментально вызванных патологиях и восстановительных процессах без воздействия и в присутствии различных биологически активных веществ, проявления, степени выраженности и роли гиперрепликации ДНК в восстановлении структуры клеточных популяций и уровня тканеспецифичеческих синтезов, а также изучение возможных проявлений эмбриональных механизмов гиперрепликзции ДНК в посткатальном развития при некоторых патологиях и в экстремальных условиях у представителей разных классов позвоночных.
Очевидно/ что изучение биологии клетки, ее структур и процессов метаболизма на современном этапе прежде всего предполагает исследование их химической природы. Цитоспектрофотометрия является главным методом, с помощью которого возможно исследовать вещества непосредственно там, где они синтезируются и функционируют, не нарушая, при этом, структуры как клеток, так и популяции в целом. Поэтому большое внимание в работе было уделено также оптимизации методов ОШоспектрофотометрии и разработке новых методов объективной оценки распределения исследуемых вешеств в клетке.
Для разрешения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1.Усовершенствовать методы цитофотометрии препаратов, окрашенных по Фельгену, для исследования ДНК.
2.Разработать - новые методы объективной оценки распределения веществ и анализа структуры хроматина в клетке.
3.Используя в комплексе современные методы аналитической биологии клетки исследовать:
а. Зависимости между процессами пролиферации и
цитодифференцировки при регенерации стабильных и постоянно
обновляющихся клеточных систем;
б. Действие биологически активных веществ на процессы
восстановления клеточных популяций при патологии и в
экстремальных условиях;
в. Динамику синтеза и накопления ДНК, РНК, суммарного и
тканеспецифического белков в клетках исследуемых популяций в
эмбриогенезе, во взрослом организме в норме, патологии,
экстремальных условиях и при воздействии биологически
активными веществами;
4.Сравнить механизмы дифференцировки клеточных популяций в эмбриональном развитии с механизмами восстановительных процессов этих же популяций во взрослом состоянии в экстремальных условиях.
5.Выяснить роль, и значение гиперрепликации ДНК в восстановительных процессах.
На основе проведенных нами методических исследований Сыли усовершенствованы существующие и разработаны новые методы подготовки биологического материала для количественных цитохимических исследований ДНК и анализа данных, получаемых с помощью сканирующей цитофотометрии и ЭВМ. Даны рекомендации по применению фиксаторов, условий гидролиза, окрашиванию препаратов, способам приготовления реактива Шиффа. В результате этих работ значительно повысилась точность измерений и снизился коэффициент вариации до 3,5%, Vfro при наличии современной сканирующей аппаратуры в комплексе с ЭВМ сделало возможным анализ структуры цитологических объектов на основе количественной оценки распределения в них изучаемого вещества. Это в свою очередь позволило на основе разработанных нами новых методов объективной оценки распределения веществ в клетке и имеющихся в литературе данных, создать программное обеспечение паспортизации клеток, которое может быть рекомендовано для использования в биологических лабораториях и в практике медицинских учреждений. Многие из наших рекомендаций используются в методических руководствах ( см, "Методические рекомендации по использованию методов количественной цитохимии для определения состава клеточных популяций и свойств хроматина у растений и животнх", из-во АФИ, Л.,1984).
Впервые проведено систематическое исследование взаимосвязей между гиперрепликацией ДНК в различных её проявлениях и процессами регенерации при патологии и в экстремальных условиях на специально подобранных клеточных системах, представляющих разные типы клеточных популяций - стабильные и постоянно обновляющиеся:
а) впервые получены новые данные о динамике синтеза и содержания
нуклеиновых кислот и белков, а также о распределении экзогенных
панкреацитов и тепатоцитов по плоидности на разных стадиях
экспериментально вызванного острого панкреатита у крыс; показано,
что в неповрежденной части поджелудочной железы и в печени
кардинально изменяется распределение исследуемых клеток по классам
плоидности и начинают преобладать (свыше 60% популяции) 4с и
(2с+2с)клетки, характеризующиеся значительно более высокой
активностью синтеза и накопления РНК и белка, чем у аналогичных
клеток в норме.
б) Показано, что тиосульфат натрия в первой фазе острого
панкреатита повышает устойчивость панкреацитов и гепатоцитов к
действию токсинов и снижает активность протеаз, образующихся при
некробиозе, а во второй фазе стимулирует синтез ДНК в этих клетках
и их размножение, ускоряя темпы восстановления численности
жизнеспособных клеток и предотвращает переход панкреатита в
хроническую форму.
в)Впервые среди макрофагов лимфоузлов и селезенки мышей линии СНА выявлены клетки с гипердиплоидным и тетраплоидным содержанием ДНК в ядрах. При канцерогенезу доля таких клеток уменьшается в связи с их миграцией в опухоль, Введение ретиноидов восстанавливает численность гиперреплицированных макрофагов до уровня у интактных мышей и доля синтезирующих ДНК клеток достирает 2,8%.Вероятно
ретиноиды ускоряют процессы созревания макрофагов, их активацию и
обновление.
v) Показана способность эритроидных клеток взрослых птиц избирать
разные пути дифференцировки и специализации в зависимости от
остроты экспериментально вызванной анемии у птиц, направленные на
ускорение восстановления численности эритроцитов и титра
гемоглобина в крови и обусловленные разными способами
гиперрепликации ДНК и степенью в& выраженности.
д)Нами открыт неизвестный путь ускоренной дифференцировки
первичных эритроидных клеток в терминально специализированные
клетки-ретикулоциты, сопряженный с выходом их из цикла в фазах Gt и
Єг,и направленный на повышение содержания гемоглобина в этих
клетках.
е) Впервые показано, что в первичных эритроидных клетках куриных
зародышей происходит синтез и накопление экстрахромосомной ДНК,
которая локализуется в акцессорных ядрах и обусловливает
накопление повышенного количества гемоглобина в этих клетках.
ж) Впервые показано, что в постнатальном развитии клеточных
популяций в экстремальных условиях у представителей разных классов
позвоночных возможно проявление эмбриональных механизмов
гиперрепликации ДНК, не имеющих места в нормальных условиях их
жизнедеятельности.
Наши исследования позволили выяснить, что гиперрепликация ДНК играет важную роль не только а развитии клеточных популяций, но и при патологии, и в экстремальных условиях. Механизм гиперрепликации ДНК не обязательно действует постоянно, а скорее всего обеспечивает жизнедеятельность и функционирование клеточных систем на стыке процессов пролиферации и дифференцировки и определяет способность клетки решать задачи, предусмотренные программой раззития в особых, экстремальных для возможностей популяций условиях, поэтому гиперрепликацию ДНК наряду с пролиферацией и дифференцировкой следует отнести к фундаментальным явлениям в развитии биологических систем, закрепленных в процессе эволюции.