Введение к работе
Актуальность работы. Гормон роста является одноцепочечным полипептидным гормоном с молекулярной массой 22кДа и секретируется передней долей гипофиза. ГР действует на метаболизм белков, углеводов и жиров, стимулирует рост и дифференциацию клеток.
Возможными посредниками осуществления биологической активности ГР являются инсулиноподобные факторы роста,-вырабатываемые клетками печени в ответ на действие ГР.
Показано и прямое действие ГР на клетки, опосредованное
специфическими мембранными белками, обладающими высоким,
сродством к ГР. В 1987г Leung и соавторы клонировали кДНК рецептора
ГР (РГР) из печени кролика и определили нуклеотидную
последовательность. Оказалось, что этот белок содержит 638, аминокислот,
включая сигнальную последовательность. Зрелый рецептор состоит из
внеклеточного гормоносвязывающего, трансмембранного и
внутриклеточного участков. В 1989г Godowski и соавторы картировали ген РГР человека и показали, что он представлен единственной копией в геноме и занимает участок размером более 87 т. п. н. Кодирующая часть гена состоит из 9 экзонов. Белковыми продуктами гена являются полноразмерный мембранный рецептор и растворимый белок, содержащий только внеклеточную часть рецептора. Последний обнаруживается в сыворотке и цитозольных фракциях клеток. Основным источником секреции сывороточного белка, связывающего ГР (ВСГР) является печень, в которой этот белок образуется у одних видов путем протеолиза мембранного рецептора, у других - в результате трансляции альтернативно сплайсированной мРНК.
У грызунов ВСГР содержит уникальную гидрофильную С-концевуто последовательность, кодируемую отдельным экзоном и транслируется с альтернативно сплайсированной мРНК РГР.
Рентгеноструктурный анализ комплекса ВСГР с ГР дает основание полагать, что при связывании ГР с рецептором образуется комплекс, состоящий из одной молекулы гормона и двух молекул рецептора. Показано, что часть этого комплекса интернализируется и подвергается деградации, или частичному протеолизу и, либо высвобождается во внеклеточную среду в виде ВСГР, либо переносится в ядро. Образование комплекса ГР с рецептором приводит к активации внутриклеточных тирозинкиназ семейства JAK киназ, протеинкиназы С, протеинкиназ, активируемых митогенами (МАР-киназ), которые участвуют в передаче сигнала ГР. Таким образом, действие ГР на клетки в первую очередь определяется наличием рецепторов на их поверхности и изучение факторов, регулирующих экспрессию РГР представляет особый интерес.
Экспрессия гена РГР в печени является дифференцированным по половому признаку процессом. Известно, что содержание РГР в печени самок выше, чем у самцов (Baxter R. С, Zaltsman Z., 1984). Кроме того, характер экспрессии гена РГР у крысы находится под контролем гипофизарных гормонов, в первую очередь самого ГР. Известной особенностью структуры мРНК РГР у крысы к началу нашей работы
являлась гетерогенность 5'-нетранслируемой области (5'-НТО), что указывало на наличие нескольких промоторов и 5'-нетранслируемых экзонов гена и предполагало возможность регуляции его экспрессии на уровне транскрипции и трансляции.
Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение экспрессии альтернативных вариантов мРНК РГР/ВСГР крысы, отличающихся структурой 5'-НТО. Предполагалось выяснить возможную тканеспецифичность их экспрессии, ее зависимость от возраста, пола и физиологического состояния животных. В связи с половой дифференциацией экспрессии гена РГР в печени ставилась также задача сравнить уровень разных форм мРНК в печени самцов и самок крысы, изучить влияние гормонального статуса на содержание разных изоформ мРНК, используя модели гонадэктомированных и гипофизэктомированных животных.
В ходе работы были поставлены и решены следующие задачи:
-
получение плазмид, содержащих промотор РНК полимеразы фага Т7 и фрагменты 5'-НТО мРНК РГР для получения антисмысловых РНК-зондов и смысловых РНК для использования их в качестве внутреннего стандарта;
-
отработка метода защиты гибридов РНК-РНК от действия РНКазы для выявления альтернативных форм 5'-НТО мРНК РГР, в том числе количественного варианта метода;
-
сравнительный анализ альтернативных форм мРНК, содержащих разные 5'-НТО, в различных тканях самцов и самок крысы;
-
сравнительный анализ экспрессии альтернативных форм мРНК в печени крысы в зависимости от пола и возраста;
-
сравнительный анализ экспрессии альтернативных форм мРНК в печени гонадэктомированных крыс, гонадэктомированных крыс, обработанных половыми стероидными гормонами, и гипофизэктомированных крыс;
-
изучение влияния трансплантации донорных гипофизов в почечную капсулу самцов крысы на экспрессию гена РГР в печени;
-
выявление изменений уровня альтернативных форм мРНК, кодирующих собственно мембранный рецептор (РГР) и белок, связывающий гормон роста (БСГР) в печени самок крысы на разных стадиях беременности и лактации.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые детально изучена экспрессия альтернативных форм мРНК РГР крысы, отличающихся структурой 5'-нетранслируемых областей. Впервые показано, что одна из этих форм - мРНК типа I специфична для печени, причем характер её экспрессии носит ярко выраженную зависимость от возраста и пола. В печени самцов её уровень незначителен, в печени половозрелых самок она легко выявляется разными методами (Northern-гибридизация, ?ащита гибридов РНК-РНК от действия РНКаз), причем её содержание значительно увеличивается при беременности. Полученные результаты позволили объяснить существовавшее в литературе противоречие между практически одинаковым уровнем мРНК РГР в печени самок и самцов и существенными различиями в содержании РГР (гормон-связывающих сайтов) на поверхности гепатоцитов самок и самцов.
Получено дополнительное подтверждение существования альтернативных промоторов гена РГР крысы и предложена гипотеза, согласно которой более высокое содержание РГР в печени самок, а также дальнейшее повышение содержания РГР и особенно БСГР у беременных самок связано с существованием особой формы мРНК, отличающейся структурой 5-нетранслируемой области и предположительно имеющей более высокую трансляционную активность.
Изучено влияние половых стероидных гормонов и гормона роста на характер экспрессии альтернативных форм мРНК РГР в печени крысы. Впервые показано, что трансплантация донорных гипофизов в почечную капсулу самцов крысы, которая выводит гипофиз из-под контроля гипоталамических факторов и вызывает изменения паттерна секреции ГР - снижение амплитуды пиков секреции и повышение базального уровня ГР, индуцирует экспрессию в печени самцов мРНК РГР с 5'-нетранслируемой последовательности типа I. Этот факт указывает на участие ГР гв регуляции активности альтернативного, специфичного для печени самок промотора гена РГР крысы и открывает перспективы выяснения механизмов этой регуляции. Выяснение механизмов полоспецифической регуляции экспрессии гена РГР и участия в ней ГР имеет важное практическое значение в связи с важной ролью ГР в половой дифференцировке функций печени.
Особую практическую значимость такие исследования имеют в связи с разной половой предрасположенностью к развитию ряда широко распространенных заболеваний, связанных с биохимическими изменениями функций печени (атеросклероз, желчнокаменная болезнь и
др.).
Апробация диссертации. Материалы диссертации ' были представлены на XI Российско-французском симпозиуме "Организация и экспрессия генома эукариот и прокариот", Конкарно, Франция, 1992.; конференции, посвященной 80-летию академика АМН Н.А.Юдаева, Москва, 1993 год; III Европейском эндокринологическом конгрессе, Амстердам, Нидерланды, 1994.; Международном симпозиуме "Молекулярная биология на рубеже XXI века", Москва-Углич, 1994.; 10-м Международном эндокринологическом конгрессе, Сан-Франциско, США, 1996.; 2-м съезде Биохимического общества РАН, Москва, 1997 г.5-й конференции "Геном человека -96", Черноголовка, 1996 .год; Конкурсе научных работ Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, 1994.; семинарах лаборатории эндокринологии биологического факультета МГУ и лаборатории гормонов и рецепторов Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в б печатных работах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Она изложена на 87 страницах и содержит 18 рисунков.