Введение к работе
Актуальность проблемы. Настоящая работа посвящена изучению молекулярных механизмов, контролирующих активацию транскрипции глобиновых генов в эритроидных клетках кур. Домен а-глобиновых генов кур, наряду с доменами глобиновых генов других позвоночных животных, в течение многих лет является моделью для изучения механизмов регуляции транскрипции. В предшествующих работах идентифицирован сложный комплекс регуляторных элементов, контролирующих работу этого геномного домена. Однако до сих пор остается неясным, как эти регуляторные элементы взаимодействуют друг с другом, обеспечивая активацию транскрипции глобиновых генов и переключение их экспрессии по ходу развития организма Довольно давно была предложена гипотеза, постулирующая, что удаленные регуляторные элементы напрямую взаимодействуют с промоторами контролируемых ими генов. К сожалению, до последнего времени отсутствовал экспериментальный подход, позволяющий проверить эту гипотезу. В настоящее время такой подход (метод фиксации конформации хромосомы, ЗС) существует. Мы использовали этот подход для того, чтобы выяснить, каким образом изменяется пространственная конфигурации домена а-глобиновых генов при переходе его в потенциально-активное состояние и, далее, при начале экспрессии глобиновых генов. Полученные результаты расширяют наши знания о механизмах регуляции транскрипции у высших эукариот, что и определяет актуальность настоящей работы. В более узком плане, работа актуальна еще и потому, что раскрывает ряд важных особенностей регуляции экспрессии именно глобиновых генов, нарушения в работе которых вызывают тяжелые заболевания человека и хозяйственно-важных домашних животных.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизмов активации транскрипции а-глобиновых генов у курицы. Для раскрытия этих механизмов мы решили выяснить, происходит ли пространственное взаимодействие каких-либо регуляторных элементов домена между собой и с промоторами а-глобиновых генов в условиях, когда домен неактивен, и изменяется ли пространственная конфигурация домена при активации транскрипции глобиновых генов. Для ответа на эти вопросы были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Отработать систему искусственной дифференцировки культивируемых куриных пре-эритробластов в эритроциты.
Используя полученную систему, с помощью метода фиксации конформации хромосомы (ЗС) изучить пространственную организацию домена а-глобиновых генов в клетках до и после активации транскрипции глобиновых генов.
Сравнить пространственную организацию домена а-глобиновых генов в культивируемых эритроидных клетках с таковой в нормальных куриных эритроцитах и клетках неэритроидного происхождения.
Научная новизна и практическая ценность работы. Уже более пяти лет метод ЗС (Chromosome Conformation Capture, в переводе с англ. «фиксация конформации хромосомы») активно применяют во всем мире для изучения пространственных взаимодействий между различными участками генома. В России,однако,-использование-данного-метода-до-последнего-времени-не увенчивалось успехом. В ходе диссертационной работы были преодолены все технические трудности, связанные с проведением экспериментов, поставлены необходимые контроли и получены достоверные, воспроизводимые результаты. В работе рассмотрены теоретические основы метода ЗС с уделением особого внимания проблемам, с которыми сталкивается исследователь при проведении ЗС-анализа, и путям их решения.
Сама работа посвящена изучению пространственной организации домена а-глобиновых генов кур. Хотя подобные исследования уже проводились для некоторых геномных локусов, среди которых и домен а-глобиновых генов мыши, настоящее исследование имеет ряд преимуществ. Так, впервые было осуществлено сравнение пространственной конфигурации домена а-глобиновых генов в нескольких типах клеток, включая культивируемые пре-эритробласты, не экспрессирующие глобииовые гены, и те же клетки после индукции терминальной эритроидной дифференцировки, в ходе которой глобииовые гены начинают активно экспрессироваться. Такое сравнение позволило нам проследить за изменениями в пространственной организации домена, напрямую связанными с активацией транскрипции глобиновых генов, и, таким образом, выявить регуляторные элементы ДНК, контролирующие смену транскрипционного статуса домена. Результаты работы подтверждают важную роль коммуникации между удаленными участками генома в регуляции экспрессии генов.
В нескольких последних публикациях была отмечена эволюционная консервативность организации доменов а-глобиновых генов различных позвоночных животных. В данной работе впервые показано, что ключевые регуляторные события, происходящие на уровне пространственной организации домена а-глобиновых генов при активации транскрипции, различаются для птиц и млекопитающих. Более того, в настоящей работе впервые продемонстрировано избирательное взаимодействие удаленного энхансера только с одним из двух функционально связанных активных промоторов, расположенных поблизости друг от друга.
Диссертационная работа вносит существенный вклад в развитие представлений о стурктурно-функциональной организации эукариотического генома. С другой стороны, несмотря на четко выраженный фундаментальный характер, работа представляет интерес и с практической точки зрения. Новые знания о механизмах, контролирующих экспрессию генов, могут быть использованы в биотехнологии, в частности, при создании трансгенных животных.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 10-ой международной школе-конференции «Биология - наука
XXI века» (Пущино, 2006), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на конференциях «Workshop on Protein-nucleic acid interactions of the International Research Training Group GieBen/Marburg-Moscow» (Суздаль, 2007; Москва, 2008; Гиссен, Германия, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Из них статей — 3, тезисов докладов и материалов конференций — 6.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 140 страницах, содержит 21 рисунок и 3 таблицы, состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы, включающего 260 источников.
