Введение к работе
Актуальность темы. К настоящему времени известны 4 основных вида вирусов, принадлежащих роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae, способных вызвать заболевания человека различной степени тяжести. Наиболее опасным представителем данной таксономической группы является вирус натуральной оспы (variola major), обязательная вакцинация против которого была отменена в 1979 году после завершения международной программы по его искоренению.
Доминирующая часть населения сейчас не обладает устойчивостью к этому опасному возбудителю, и риск возникновения эпидемии при наличии даже спорадических случаев заболевания натуральной оспой весьма велик. Потенциальная возможность возникновения заболевания должна быть учтена по ряду причин: а) живые штаммы возбудителя до сих пор сохраняются в двух официально зарегистрированных коллекциях; б) на территории США был создан прецедент применения инфекционных агентов в качестве биологического оружия; в) возможность образования новых естественных резервуаров инфекции не отрицается.
Схожую с натуральной оспой клиническую картину на ранних стадиях заболевания вызывают все патогенные для человека вирусы, принадлежащие роду Orthopoxvirus, а также вирусы простого герпеса первого (HSV-1) и второго типа (HSV-2) и вирус ветряной оспы (VZV).
Быстрый и надежный метод идентификации вирусов рода Orthopoxvirus, а также HSV-1, HSV-2 и VZV позволит выявить инфекционного агента уже на ранней стадии развития заболевания, назначить адекватное лечение и предупредить распространение инфекции.
В настоящее время актуальной проблемой в перинатологии и неонаталогии является экстренная диагностика внутриутробных инфекций, являющихся причиной ранней детской смертности, соматических и психоневрологических отклонений в развитии детского организма в
постнеонатальном периоде. Основными возбудителями опасных внутриутробных и неонатальных заболеваний являются: цитомегаловирус (CMV), вирусы простого герпеса первого и второго типа, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis. Развитие герпетической и цитомегаловирусной инфекции у новорожденных усиливается в присутствии вируса гепатита В (HBV) или в случае сочетания с различными другими возбудителями при микст инфекциях.
Своевременное применение соответствующей этиотропной и иммунопатогенетической терапии позволяет существенно снизить риск неблагоприятных исходов. Быстрый и надежный метод идентификации вышеперечисленных возбудителей позволит своевременно выявить патогенный агент у новорожденного и провести направленную терапию.
Биологический микрочип (биочип) - одна из прогрессивных современных разработок, являющаяся надежным инструментом для проведения молекулярно-биологических исследований и клинической лабораторной диагностики. Применение биочипов позволяет анализировать нескольких генетических мишеней одновременно.
Настоящее исследование посвящено разработке следующих методов идентификации возбудителей с помощью технологии биологических микрочипов: а) метода идентификации возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину на основе гибридизации на биологическом микрочипе (Герпокс), б) метода одновременной идентификации HSV-J, HSV-2, CMV, HBV на основе гибридизации на биологическом микрочипе (Нео-1), в) метода одновременной идентификации на биологическом микрочипе HSV-1, HSV-2, CMV, М. hominis, U. Urealyticum, С. trachomatis на основе ПЦР на биологическом микрочипе (Нео-2).
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание методов на основе биологических микрочипов для идентификации возбудителей неонатальных инфекций и заболеваний, имеющих схожую с натуральной оспой клиническую картину. Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:
-
Разработать метод на основе биологического микрочипа для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, VZV и вирусов рода Orthopoxvirus.
-
Разработать метод на основе биологического микрочипа для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, CMV іл HBV.
-
Разработать метод на основе биологического микрочипа для идентификации HSV-1, HSV-2, CMV, С. trachomatis, М. hominis, U. urealyticum.
-
Провести апробацию разработанных методов и сравнить результаты с результатами классических методов.
Научная новизна работы.
Впервые разработан метод на основе гибридизации на биологическом микрочипе, позволяющий одновременно выявлять HSV-1, HSV-2, VZV и вирусы рода Orthopoxvirus (Герпокс).
Впервые разработаны методы на основе биологических микрочипов, позволяющие проводить одновременно идентификацию основных возбудителей неонатальных инфекций:
-
Метод идентификации HSV-1, HSV-2, CMV и HBV на основе гибридизации на биологическом микрочипе (Нео-1).
-
Метод идентификации HSV-1, HSV-2, CMV, С. trachomatis, М. hominis, U. Urealyticum на основе ПЦР на биологическом микрочипе (Нео-2).
Практическая значимость работы.
Разработанный метод Герпокс для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, VZV и вирусов рода Orthopoxvirus позволяет быстро выявлять эпидемически опасные агенты, что делает возможным своевременное применение противоэпидемических мер.
Метод для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2.CMV и HBV на основе биологического микрочипа (Heo-J) и метод для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, CMV,M. hominis, U. urealyticum, С. trachomatis на основе биологического микрочипа (Нео-2) могут применяться в клиниках для выявления опасных инфекционных агентов у новорожденных детей, а также для обследования беременных женщин. Выбор в применении Нео-1 или Нео-2 должен быть обусловлен требованиями целесообразности (необходимая скорость анализа, технические возможности лаборатории, масштабы исследований и др.).
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины (Москва, 2006), на XX Зимней международной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008), на XII Конгрессе педиатров России (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 106 источников. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста и содержит 28 рисунков и 13 таблиц.
