Введение к работе
Аминоацил-тРНК синтетазы ( АРСазы ) играют существенную роль в процессе синтеза белка, обеспечивая строго специфическое амино-ацилирование тРНК на дорибосомном этапе биосинтеза. Эукариотичес-кие АРСазы характеризуются более сложной структурной организацией по сравнению с ферментами из прокариот. Некоторые из эукариотичес-ких АРСаз выделяются из клеток биохимическими методами в виде свободных ферментов ( например, триптофаиил-тРИК синтетаза (ТгрРС, КФ 6.1.1.2)), тогда как другие - в составе высокомолекулярных мульти-ферментных комплеков.
Сложная внутренняя структура эукариотической клетки, наличие большого количества внутриклеточных органелл и компартментов дают дополнительные возможности для регуляции белкового синтеза у эукариот. Изучение внутриклеточной локализации аминоацил-тРНК синтетаз имеет большое значение для понимания пространственной организации аппарата белкового синтеза и выяснения возможностей регуляции трансляции у эукариот за счет пространственного разделения биохимических процессов внутри клетки.
Биохимическими методами, при исследовании фракционированных клеточных экстрактов, аминоацил-тРНК синтетазы были обнаружены в цитоплазме, ядрах, хлоропластах и митохондриях, в ассоциации с рибосомами и полисомами, а также фрагментами мембран. Однако биохимические данные не позволяют сделать однозначного вывода о локализации синтетаз в интактных клетках, так как разрушение и фракционирование клеток может приводить к перераспределению ферментов между различными клеточными компонентами.
Иммуноэлектронномикроскопический подход позволяет проводить исследования без повреждения нативной структуры клеток, а высокая разрешающая способность метода обеспечивает точное картирование
внутриклеточных макромолекул. Принцип метода состоит в обработке ультратонких срезов клеток и тканей специфическими антителами, конъюгированными с электрошюплотными маркерами.
Цель и задачи исследования. Целью представленной работы было электронномикроскопическое изучение локализации аминоацил - тРНК синтетаз на ультратонких срезах с помощью комплексов специфических антител с коллоидным золотом. В ходе исследования мы решали следующие задачи:
-
Сравнительное изучение локализации свободной цитоплазматической триптофанил-тРНК синтетазы (ТгрРС, КФ 6.1.1.2) в клетках, принадлежащих к трем эволюционно различным царствам - бактериям (E.coli), архебактериям (М.halophil.us) и эукариотам;.
-
Сравнительный анализ распределения ТгрРС в разных типах эукари-отических клеток: культуре фибробластов. и клетках поджелудочной железы крысы и культуре клеток эпителия почки кролика.
-
Сравнительное изучение локализации в клетках млекопитающих ТгрРС и компонентов мультиферментного комплекса: слабо ассоциированной с комплексом аргинил-тРНК синтетазы (ArgPC, КФ 6.1.1.19), прочно связанной с комплексом глутамил - пролил - тРНК синтетазы ( CiluProPC, КФ 6.1.1.17 ) а также двух несинтетазных компонентов комплекса - полипептидов с молекулярными массами 38 и 43 кДа.
Научная новизна и практическая ценность исследования. Для решения поставленных научных задач нами был разработан метод статистической обработки экспериментальных электронномикроскопиче-ских данных, который имеет универсальный характер и может успешно применяться для тонкого картирования различных макромолекул.
Проведено сравнительное изучение локализации триптофанил-тРНК синтетазы в клетках бактерий (Б. сої і) и архсбактерий (П. halophi-lus). Показано, что распределение ТгрРС в бактериальных и архебак-
термальных клетках практически совпадает: основная часть фермента располагается в цитоплазме и на границе цитоплазмы и нуклеоида.
Изучено распределение ТгрРС в разных типах клеток млекопитаю-ющих. Выявлена локализация фермента в рибосомных зонах цитоплазмы, митохондриях и в ядре - в районах диффузного хроматина и на его границе с компактным хроматином.
Изучена локализация в клетках млекопитающих синтетаз мульти-ферментного комплекса: ArgPC и GluProPC. Показано, что распределение синтетаз комплекса и ТгрРС практически совпадает, что свидетельствует в пользу мультиферментной природы всех изученных амино-ацил-тРНК синтетаз в интактных клетках.
Исследовано распределение в клетках эпителия почек кролика двух несинтетазных компонентов мультиферментного комплекса - полипептидов с молекулярными массами 38 и 43 кДа. Показано, что полипептид р38 имеет такое же распределение в клетке, что и все исследованные синтетазы, в то время как полипептид р43 распределяется отличным от синтетаз образом.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на:
-
X Европейской конференции по электронной микроскопии, Гранада, 1992.
-
XIV Конференции по электронной микроскопии, Черноголовка, 1992.
-
V Конференции по электронной микроскопии стран Тихоокеанского региона, Пекин, 1992.
-
III Национальной конференции по электронной микроскопии, Цюрих, 1993.
-
XIII Международном конгрессе по электронной микроскопии, Париж, 1994.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания результатов и выводов. Работа изложена