Введение к работе
Прошло уже более 10 лет с момента обнаружения БИЧ - вируса, призванного причиной СПИДа. К настоящему моменту Синдром приобретенного Иммунодефицита (СПИД) зарегистрирован во всех странах мира. Причем, в некоторых развитых странах, таких как США, СІВД ухе выизл на третье место по смертности, обогнав онкологические заболевания. В мире к 1994г. выявлено более 700 тыс. больных, из них попили около 200 тыс. человек. В России 692 человека :іме:от диагноз ВИЧ-икфекцкя, 95 человек уяе умерли. По прогнозу зкепертоз В08 it 2000г. ожидается около 40 млн. инфицированных людей на Земле. Пандемия продолжает расширяться.
Соответственно возрастает необходимость в эффективных противовирусных препаратах. Существуют самые разнообразные подходы к конструированию новых химиотерапевтических средств. В подавляю-пэм большинстве экспериментальных работ поиск перспективных пре-паратез с анти-ВИЧ активность» Еедется не вслепую, а с целью подавить некоторые из известных стадий жизненного цшша вируса. С этой точки зрения перспективны исследования ранних этапов жизненного цшка БИЧ, г именно стадии проникновения, состоящей из эдге&ии, рецепіши и фузии. Ингибиторы этих процессов могут являться одновременно и инструментами фундаментального исследования, .: отлраьной точкой молекулярного дизайна новых противовирусных средств.
С другой стороны, с момента открытия ЗИЧ, одним из ключевых вопросов ретровирусологми стало изучение механизма, с помощью которого в результате Еіірусной инфекции происходит истощение едкого из классов Т-лк\"і?цитов, а іменно Т-хелперов вследствие существенного иитопатического эффекта [Gallo et al., 1984, Levy et al., 19Я4], з конечном счете приводящее к иммунодефициту при СПИДе. Согласно одной из гипотез, оснсзнуго роль з гибели клеток от ВИЧ играют процессы, опосредованные вирусными поверхностными гликопротеы;ами n.ifson et al.,1986], особенно Еирусикдуцкрован-ное слппние клеток с формированием синцитиев.
Изучение ранних ссбыттм з репликации ВИЧ затаю потому, что взаимодействие мембран вируса к клетки является критическим моментом в инфекционном процессе у сбелочечних вирусов. Именно поэтому атап проникновения БИЧ потенциально важная мишень для противовирусной терапій.
Уже показано, что соединения, содержащие отрицательно заряженные ионные группы (полианиокы), могут блокировать репликации
БИЧ в культуре клетої:. Причем, в отличие от азидотимидина и его аналогов, полианионы различной природы способны еще и подавлять слияние инфицированных и неинфицированных клеток [Mltsuya et al., 1988]. Имеющиеся на сегодняшний день данные говорят о том, что такие соединения препятствуют адсорбции вирконов на поверхности клеток, но не проникают в цитоплазму [Мещерякова, 1992], т.е. ингибировгние инфекции происходит на стадии взаимодействия вирусного гликопротеина gpl20 и рецептора клеточкой поверхности CD4.
Как уже отмечалось, ключевым момектом проникновения ВИЧ в клетку является фузия. Работами Карамова с соавт. (1992), Compans с соавт. (1990) показано, что синтетические пептиды, соответствующие N-концу трансмембранного гликопротеина ВИЧ gp41, могут влиять на функциональное состояние клеточных мембран, а также блокировать слияние клеток, вмешиваясь в процесс проникновения зир7са в клетку-мишень. В экспериментах с конъюгатами пептидов с различные белками и синтетическими полимерами было продемонстрировано, что действие пептидов зависит не только от аминокислотной последовательности пептида, но и от заряда молекулы и ее. конформадяи [Slepushkin et al., 1990, 1992]. ^ С другой стороны, имеется сведения о том, что способность ВИЧ-инфицированных клеток к слиянию не коррелирует с количеством CD4-рецепторов, но зато пропорциональна количеству экспрессирс-ванных на поверхности клеток молекул LFA-1, одного из интегрино-вых рецепторов [Gruber et al., 19Э1, Pantaleo et al., 1991]. Показано, что ВИЧ-индуцированное образование синцития требует участия интегриков, представителей суперсемейства рецепторов клеточной адгезии. Изучение противовирусной активности ингибиторов интегриновых рецепторов может оказаться кобым подходом в проблеме альтернативного механизма проникновения ВШ в клетки интегрип-опосредованным CD4-независимым путем.
Настоящая работа является частью исследований, проводимых в КИИ вирусологии им. Д.И.ИваноЕСксго РЛМН, плановая тема N65, по изучению молекулярных ыеханизмов ранних этапов жизненного цикла ВИЧ и возможности специфического химиотерапевтического воздействия на эти процессы. Ш приводим данные 1) по влиянию полианионов (сульфатированных хитозанов) на процесс проникновения ВИЧ; 2) по действию пептидов фузии из gp41 ВИЧ на репликацию ВИЧ; 3) по противовирусной активности адаоена - инактиватора интегриновых рецепторов, возможно, опосредующих альтернативный механизм проникновения ВИЧ в клетки-мишени.
- з -цель v задачи исследования
Цель работы - изучение возможностей и механизмов икгибирова-ния жизненного цикла БИЧ на стадии "ранних событий": адсорбции и фузии, соединениями волианиокнсй природы и пзптздааи фузии из_ gp41 ВИЧ-і; исследование одного яз возможных CD4-независимых путей проникновения ВИЛ з клетку мишень, путем блокирования вк-руеиндуцированного образования синциткев веществами, препятствующими гонотипической адгезии. Для достижения поставленной цели репагксь следующие задачи:
-
Исследование влияния сульфатированных производных хитина и хитозана, различающихся природой, зарядом и пространственной ориентацией заместителей в элементарном зеєнє полисахарида, на процессы ВИЧ-инфекции (вирусиндуцироваяное образование синцитиев и продукцію вирусных антигенов). Определение наиболее значшлгх фактороз для максимальной антивирусной активности этих соединений, сопоставление структур.
-
Оценга сульфатпрозанных производных хигозана, как возможных химиотералэвт:<ческих средств.
-
Изучение ілеханизма подавления ВИЧ-инфекции пептидами фузии из gp41 ВИЧ-1, путем анализа воздействия пептидов на разные этапы жизненного цикла вируса, в том числе: адсорбцию, ооратнуэ транскрипція: к интеграцию провирусного генома, а іакг.е на продукцию зкрусках антигенов и вирусикдуцироЕанное сняцитнеобразо-вание.
4 доследование влияния последовательности змннскислот, носителей и мжроокругежи пептидов, путей кх различных модификации (аминокислотных замен, кснъюгпрэвания с различными природными и синтетическими полимерами), на антивирусную активность этих соединений.
5. Оценка блокирующэк актизности соединения, являющегося ал-лсетеричееким инзктиваторсм ннтегриновых рецепторов адгезии, на процессы Зйрусиндуцирсванного образования слнциіиеь и продукцию вирусных антигенов.
Научная новизні результатов исследования.
Исследована анти-КІЧ активность некоторых производных хитина и хитозама, различжцихоя зарядом, природой и пространственным рзепололепкем , заместителей С з т.ч. сульфатных групп) в элементарном звене хитозана. Выявлено, что 3 группы еульфаті'рованкьіх производных хитозана значительно подавляют кале вирусную репликацию, гак 7 ьчрус-икдуцированное образование синцитиев в дозоза-з«скшй форме («Лео составляет О.ОВ-2.00 мкг/мл) при отсутствии
- 4 -видимой токсичности. Был сделан вывод, что для подавления репли-кативной активности ВИЧ важно наличие и местоположение сульфатной группы в звене хитозана.
Впервые показано, что расположение сульфатной группы при С-6 в цепях хитозана является необходимым, но не достаточным условием проявления максимальной анти-ВИЧ активности для данного класса полиаминогликанов, при этом увеличение. содержания этих групп в цепях хитозана выше определенного значения, вероятно, не играет существенной роли. Оіевидно, важное значение имеет молекулярная масса и полидесперсность этих соединен, а также природа и пространственное расположение других заместителей в структурном звене хитозана.
В целях возможного использования препаратов сульфатированных производных хитозана рассчитан химиотерапевтический индекс для наиболее активных соединении .
Впервые исследовано влияние 22-членного пептида из gp41 ВИЧ-1 в различных модификациях (в том числе конъюгированного с некоторыми природными и синтетическими полимерами) на вирусную адсорбцию и ВИЧ-индуцированное образование синцитиев. Установлено, что пептиды фузии ннгибируют синцитиеобразование и продукцию вирусных антигенов, не препятствуя специфически адсорбции вируса на поверхности клеток и не подавляя активность обратной транскрип-тазы вируса, но уменьшают количество интегрированной провирусной ДНК. Эти данные позволили сделать вывод о том, что пептиды фузии ВИЧ направленно воздействуют на процесс проникновения вируса в клетку через клеточную мембрану.
Доказано, что действие лептидов фузии на ВИЧ-инфекцию является специфическим, и для его проявления важны не только аминокислотная последовательность и наличие свободного N-конца молекулы пептида, а также природа, заряд и пространственная организация носителя.
Установлено, что эллостеричеекий инактиватор интегриновых рецепторов - адкоен - способен лодавлять вирусиндуцированное образование синцитиев и продукцию вирусных антигенов. Это свидетельствует о роли интегринов і процессах слияния клеток, а также может указывать на существование альтернативного механизма проникновения ВИЧ в клетки (интегрин-опосредованныи CD4-независимый путь).
Выдвинуто предположение, что комплексное.применение ингибиторов рецепции, адгезии и фузии может быть эффективным способом предотвращения ВИЧ-инфекции клеток-мишеней.
- s -
Значение работа для теории и практики
Диссертационная работа представляет собой часть исследований, проводишх, в НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН, посвященных изучению молекулярных механизмов проникновения ВИЧ в клетки и возможност:; химиотерапевтичеекого воздействия на эти процессы.
Отобранные с7льфатироЕанные производные хитозака, обладающие высоксй анти-ВИЧ аістивностью, особенно при подавлении вирусинду--парованного образования сичцитиев, с максимальным химиотерапев-тическим индексом. В дальнейпэм они могут быть рассмотрены в качестве возможных перспективних средств для лечения СПИД.
Исследование влияния синтетических пептидов из gp41 на ВИЧ-инфекция подтвердило специфичность действия этих препаратов. Установлена стадия жизненного цикла вируса, которую блокируют эти пептиды - фузия.. Обнаружение конкретной молекулярной мишени для пептвдомимэтиков дает ключ к пониманию молекулярного механизма проникновения ВИЧ в кнетку-мишекь.
Обнаруженная нами противовирусная активность аджоена - ал-лостерического инактиватора интегриновкх рецепторов, может служить подтверждением возможности существования альтернативного механизиа проникновения ВИЧ в клетки: интегрин-опосредованного СМ-несавискмого пути.
Применение аджоена или других ингибиторов интегринов в комбинации с традиционными противовирусными средствами может иметь перспективы при лечении ВИЧ-инфекции.
Новые научные факты, представленные в диссертации, дополняют современные представления о механизмах взаимодействия вируса с клеткой-мишенью.
ОсноЕнаэ полояекля, кжесзиые на галряу
1. СульфзткрованЕые производные хитозака являются эффективны
ми ингибиторами зирусиндуцкрованяого образования синцитиев и
способны подазллгь реп^-садию БИЧ.
2.- Антивирусная активность прояззодпнх хитозана зависит от наличия и местоположения сульфатной группы в элементарном зеєнє хитозана. Важное значение кмгет молекулярная масса и поли-десперснсоїь ггих соединений! а такие природа и пространственное расположение друг:ос заместителей.
2. Пептиды фузии, соответствующие N-концевой области gp41
ЕИЧ, ішгибируют вирусиядуціфсвакное образование синцтнев и про
дукция вирусных антиггноз, направленно блокируя процесс слияния
вирусной оболочки с клеточной мембраной (фузию).
4. Действие пептидов фузии на ВИЧ-инфекцию язляется спецкфи-
- б -
чбсгаш и для его проявления важны не только аминокислотная -последовательность и наличие свободного N-конца молекулы пептида, но и природа, заряд и пространственная организация носителя.
5. Алдостеричоский инактиватор интегриковых рзцепторов - ад-жоен - способен подавлять' вирусиндуцированкое синцитиеобразова-ние и репликацию ВИЧ, что свидетельствует о роли интегринов 2 процессе слияния клеток, а также может указывать на существование альтернативного механизма проникновения ВИЧ в клетки (ингег-рин-опосредованный ОМ-незавизимый путь).
Публикация результагоз исследования и здробсл?:» работа,
По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Основные результаты представлены на конкурсе молодых ученых в НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМЧ а 1995г, на II мэздуна-родной конференции по СПИДу (Ст. Петербург, 1993).
Диссертация апробирована 23.12.93 на конферэнции отдела молекулярной биологии вирусоз КИИ вирусологии им.Д.К.Ивановского РАШ.
Объем и структура работы