Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Обзор методов искусственной эволюции in vitro 10
1.1.1. Классификация методов 14
1.1.2. Методы, основанные на мутагенезе 17
1.1.3. Методы, основанные на рекомбинации 21
1.1.4. Методы скрининга и селекции 47
1.1.5. Применение ДНК шаффлинга 48
1.1.6. Искусственная эволюция in silico (компьютерное моделирование) 49
1.1.7. Дальнейшие перспективы развития методов искусственной эволюции 51
1.2. Фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза), ее продуценты и продукты реакции
1.2.1. Микроорганизмы - продуценты ЦГТаз 53
1.2.2. Механизм действия и свойства ЦГТаз 56
1.2.3. Свойства и применение циклодекстринов 59
1.2.4. Поиск и получение новых ЦГТазных штаммов 61
2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследований 63
2.2. Микробиологические методы
2.2.1. Питательные среды 63
2.2.2. Селективные среды и буферы 64
2.2.3. Условия культивирования и инокуляции 70
2.2.4. Отбор почвенных образцов, получение чистых линий, микроскопия 71
2.3. Биохимические методы
2.3.1. Определение оптической плотности биомассы 71
2.3.2. Определение циклодекстрин глюканотрансферазной активности 71
2.4. Молекулярно-биологические методы исследований
2.4.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК 72
2.4.2. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 73
2.4.3. Электрофорез фрагментов ДНК в полиакриламидном геле 74
2.4.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля 74
2.4.5. Очистка ДНК хроматографией с ДЭАЭ-целлюлозой 74
2.4.6. Расщепление ДНК рестриктазами 75
2.4.7. Выделение векторной ДНК «медленным» способом 75
2.4.8. Лигирование фрагментов ДНК с векторной ДНК 76
2.4.9. Подготовка компетентных клеток 76
2.4.10. Трансформация компетентных клеток Е.coli плазмидной ДНК 77
2.4.11. Получение одноцепочечной ДНК 78
2.4.12. Фрагментирование ДНК при помощи ДНКазы I и ультразвука 79
2.4.13. ДНК шаффлинг 79
2.4.14. Выделение и очистка тотальной ДНК 81
2.4.15. Геномный шаффлинг 82
2.4.16. ДНК/геномный шаффлинг 83
2.4.17. Анализ тотальных ДНК при помощи метода RAPD 84
2.5. Реактивы и материалы 85
2.6. Составы использованных стандартных растворов 87
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Проведение асимметричного ДНК шаффлинга (с одно и двуцепочечными ДНК) 88
3.2. Скрининг и отбор штаммов для геномного шаффлинга 97
3.3 Проведение геномного шаффлинга между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 12 и ЦГТазным штаммом Bacillus sp. 1069 98
3.4. Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 1 100
3.5. Проведение ДНК/геномного шаффлинга между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 9 и ЦГТазным штаммом Paenibacillus sp. 1005 102
3.6. Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 2 107
3.7. Проведение ДНК/геномного шаффлинга между ЦГТазным штаммом Paenibacillus sp. 839 и алкалофильным денитрификатором Bacillus nitritophilus IB-256 110
Заключение 121
Выводы 126
- Фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза), ее продуценты и продукты реакции
- Биохимические методы
- Скрининг и отбор штаммов для геномного шаффлинга
- Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 2
Введение к работе
Актуальность темы. Искусственная (направленная) эволюция белков как новое течение в биотехнологии возникла в качестве инструментария для осуществления белковой инженерии. По сути, искусственная эволюция, в отличие от эволюции естественной, является более избирательной, имеет определенную специфическую цель, ограничена во времени, и, главное, контролируется экспериментатором, хотя ее ключевые процессы (мутации, рекомбинация и скрининг) в общем имитируют естественно протекающие в природе процессы.
Работы по направленной эволюции белков, а именно по химическому и радиационному мутагенезу, начали проводиться с начала 80-х гг. Начало 90-х гг. знаменует собой наступление промышленной эры молекулярной биотехнологии. Бурное развитие этой отрасли, рост числа предприятий диктует необходимость получения новых, безопасных для здоровья человека биокатализаторов естественного происхождения. В 1994 г. появляется принципиально новый подход в молекулярной эволюции - ДНК шаффлинг (от английского слова "shuffling" - перетасовка), который указал перспективу перехода от работ по мутагенезу к использованию рекомбиногенных методов или, иначе, от простой асексуальной репродукции in vitro к сексуальной. С момента опубликования первых данных об удачном осуществлении экспериментов по ДНК шаффлингу (Stemmer, 1994а; 1994b) эта техника получила широкое распространение и практическое применение. На его основе было создано множество методов (Zhao et al., 1998; Ostermeier, 1999; Abecassis et al., 2000; Gibbs et al., 2001; Ness et al., 2002; Zha et al., 2003). Еще одним толчком к развитию методов направленной эволюции послужил переход от работ на уровне субгеномных фрагментов к целым микробным геномам с целью аккумуляции и комбинирования полезных мутаций от двух и более искусственно выбранных «родителей» в одном организме.
В качестве модели для наших экспериментов по искусственной эволюции in vitro был выбран промышленно важный фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза) и его продуценты. ЦГТаза обладает уникальным свойством превращать крахмал в циклодекстрины (ЦД), широко применяемые в различных отраслях промышленности. Способность к синтезу этого фермента встречается среди прокариот очень редко, что позволяет использовать этот признак в качестве маркерного и проводить селекцию с большой точностью.
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение возможности осуществления in vitro ДНК шаффлинга между ранее секвенированными генами а- и (3- ЦГТаз, клонированными в плазмиде pBluescript SK(-), и имеющими около 60% гомологии на нуклеотидном уровне; изучение возможности получения in vitro химерных циклодекстриногенных штаммов при помощи геномного и ДНК/геномного шаффлинга. Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:
1. Выделение одноцепочечных и двуцепочечных ДНК а- и (3- ЦГТаз, клонированных ранее в плазмидном векторе pBluescript SK(-) и получение их фрагментов размером 150-300 пар нуклеотидов;
2. Проведение двухраундового ДНК шаффлинга путем рекомбинации одноцепочечных и двухцепочечных ДНК, взятых в разных пропорциях, для получения случайным образом восстановленного полноразмерного гена;
3. Скрининг и селекция кандидатов для геномного и ДНК/геномного шаффлинга среди ЦГТазных штаммов и почвенных изолятов;
4. Проведение геномного шаффлинга при помощи слияния протопластов между циклодекстриногенным и алкалофильным бациллярными штаммами;
5. Проведение ДНК/геномного шаффлинга посредством трансформации протопластов алкалофильного штамма тотальной ДНК ЦГТазного штамма (схема 1) и осуществление трансформации протопластов ЦГТазного штамма тотальной ДНК галоалкалофильного бациллярного штамма (схема 2);
6. Скрининг и селекция клонов, обладающих амилолитической и ЦГТазной активностью, полученных в результате геномного и ДНК/шаффлинга; сравнительный анализ отобранных и исходных штаммов методом RAPD. Научная новизна работы. Впервые проведен асимметричный ДНК шаффлинг генов а- и (3- ЦГТаз с использованием исходных матричных ДНК, представленных разными формами этой молекулы, взятыми в различных пропорциях для преимущественного отжига 5 —»3 -цепи ДНК от одной ЦГТазы и 3 - 5 -цепи другой. Проведен межвидовой однонаправленный перенос генов in vitro путем индуцированной полиэтиленгликолем (ПЭГ) трансформации регенерирующих протопластов одного бациллярного штамма с помощью тотальной ДНК другого и впервые получены жизнеспособные химерные конструкции, обладающие наряду с сохранением прежних (ЦГТазной активности) и новыми свойствами (способностью к анаэробному росту в присутствии нитрата и/или нитрита, рН-толерантностью и солеустойчивостью). Таким образом была показана возможность осуществления искусственной эволюции in vitro применительно к нашей модели исследования и разработаны соответствующие методы.
Практическая значимость работы. Разработан метод асимметричного ДНК шаффлинга, позволяющий повысить выход химерных конструкций, состоящих из фрагментов родительских генов, и предложен метод однонаправленного переноса генетического материала при помощи межвидовой высокоэффективной трансформации бактериальных протопластов тотальной ДНК другого организма. В результате ДНК/геномного шаффлинга получены штаммы рН- и галотолерантных рекомбинантов, обладающие ЦГТазной активностью и способные к росту в анаэробных условиях на среде с нитратом и нитритом. Полученные химерные культуры могут быть использованы в качестве модели для дальнейших исследований, а также для создания промышленных продуцентов ЦГТаз.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 52-й конференции студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (Уфа, 2001); на IV республиканском конкурсе научных работ студентов РБ (Уфа, 2002); на III Съезде Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); на 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002); на XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002); на 11-том Европейском Конгрессе по Биотехнологии (Базель, Швейцария, 2003); на II конкурсе научных работ молодых ученых и аспирантов УНЦ РАН и АН РБ (Уфа, 2003); на XVI зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования; главы, посвященной результатам собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель включает 15 отечественных и 240 зарубежных источников литературы.
Фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза), ее продуценты и продукты реакции
Фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза; 1,4-а-глюканотрансфераза, циклизующая, КФ 2.4.1.19) катализирует реакции диспропорционирования и циклизации, способствуя утилизации крахмала у ряда почвенных микроорганизмов. Продуктами реакции являются циклодекстрины (ЦД) с различной степенью полимеризации (наиболее распространены в природе и изучены ЦД, состоящие из 6, 7 и 8 глюкозных единиц, известные как а-, (3-, у- ЦД) (рис. 1.2). Однако в природе существуют циклические глюканы с большими степенями полимеризации 9-31 (Koizumi et al., 1999). При равных условиях конверсии препараты из разных микробиологических источников продуцируют существенно разное количество и тип ЦД. Впервые ЦД были открыты Виллирсом в 1891 г., но уже Шрадингер причислил их к декстринам. В настоящее время за этим классом веществ прочно закрепилось название циклодекстрины. Циклодекстринами называют полигомологичный ряд с общей формулой (СбНю05)п- Структурной единицей макроциклов является a-D-глюкоза в пиранозной форме (рис. 1.3), имеющая конформацию кресла С1. Остатки глюкозы соединены 1,4-гликозидными связями. ЦД со степенью полимеризации п 6 по стерическим причинам невозможны. Наибольший интерес для исследователей и практиков представляют три первых возможных гомолога с п=6, 7 и 8, которые обладают фиксированной конформацией и, соответственно, осевой симметрией (табл. 1.4). Специфическое связывание глюкозных единиц придает молекуле ЦД коническую структуру с гидрофобной полостью определенного объема. К настоящему времени бактерии являются единственным микробиологическим источником этого фермента. Подавляющее число продуцентов ЦГТаз относится к роду Bacillus (виды circulans, subtilis, firmus, ohbensis, lentus, halophilus и так далее), хотя циклодекстриногенные штаммы были также обнаружены у родов Micrococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Thermoanaerobacter и Clostridium (Mattsson, 1994). Культура под названием Bacillus amylobacter (позднее идентифицированная как Clostridium butyricum) стала первым описанным в литературе продуцентом ЦД (Villiers, 1891).
Десятилетие спустя был описан штамм Bacillus macerans (Shardinger, 1904), который до настоящего времени является наиболее часто используемым источником а-ЦГТазы (в качестве источника Р-ЦГТазы в промышленности используют штамм Bacillus circulans). Клетки В. macerans представлены палочковидными, спорообразующими, грамположительными бактериями, которые относятся к аэробам, и лишь недавно этот вид был причислен к роду Paenibacillus на основании сравнительного анализа последовательностей 16S РНК бацилл (Ash et al., 1993-94). Культуры данного вида желатин не разжижают, индол не образуют, из глюкозы, сахарозы и лактозы образуют кислоту с выделением газа. Необходимо также отметить, что приведенная выше работа Шардингера явилась первым достаточно обстоятельным исследованием, касающимся микроорганизмов В. macerans, которые получили название "бациллы Шардингера", выявляемые же при окрашивании йодом кристаллические включения ЦД известны как "кристаллы Шардингера". В научно-прикладном плане ценным является обнаружение продуцентов ЦГТаз среди экстремофильных штаммов (Nakamura et al., 1976; Wind et al., 1992; Mattsson et al., 1995; Tachibana et al, 1999; Ohdan et al., 2000a; Hashimoto et al., 2001): алкалофильных, термомостабильных, галофильных. На основе анализа уровня гомологии аминокислотных последовательностей зрелых ферментов построено филогенетическое дерево сравниваемых видов и штаммов микроорганизмов - продуцентов ЦГТаз, демонстрирующее существование достаточно обособленных групп ферментов. Показано, что все сравниваемые а-, /?- и у- ЦГТазы из родов Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus и Thermoanaerobacter имеют одного общего предка и являются результатом дивергенции, тогда как происхождение ЦГТазы Klebsiella pneumoniae имеет независимый и в то же время конвергентный характер. Также показано существование как высокогомологичных, так и несколько дивергировавших участков (Бикбулатова и др., 2000). 1.2.2. Механизм действия и свойства ЦГТаз ЦГТазы способны катализировать три основных типа реакций: - Внутримолекулярное трансгликозилирование (циклизация); Крахмал- ЦД + мальтоолигосахариды, Gn » а-ЦД + /ЩД + r-W + Gn.(6+7+8); - Межмолекулярное трансгликозилирование (диспропорционирование); 2Мальтоза мальтотриоза + глюкоза, ЦД + акцепторы линейные мальтоолигосахариды, Крахмал + акцепторы мальтоолигосахариды; - Гидролиз крахмала, мальтоолигосахаридов и ЦД; Крахмал мальтоолигосахариды. Первые две реакции обратимы и связаны с переносом части 1,4-D-глюкапиранозной цепи к акцептору, в виде акцептора чаще всего выступает С4 гидроксильная группа в конце глюкановой цепи. Главное отличие ЦГТазы от других крахмалрасщепляющих ферментов состоит в образовании ими нередуцирующих, циклических олигосахаридов в качестве конечного продукта. В самом начале реакции ЦГТаз на крахмал протекает совершенно беспорядочное расщепление субстрата с одновременной их циклизацией, причем циклизация и отщепление боковой цепочки протекают одновременно. Образование высокомолекулярных ЦД в начальный период реакции является характерной особенностью ЦГТаз, что вытекает из физиологических особенностей микроорганизмов-продуцентов. ЦД являются лишь промежуточными запасными питательными веществами - источниками глюкозы и/или низкомолекулярных линейных олигосахаридов, так как на средах с глюкозой в качестве единственного источника углерода ни один из изученных циклодекстриногенных штаммов не продуцирует ЦГТазу, а при увеличении продолжительности реакции в конце концов все ЦД превращаются в низкомолекулярные линейные формы. Работами ряда авторов показана четкая зависимость накопления фермента от содержания в среде крахмала. Выявлено также, что повышение ЦГТазной активности находится в прямой зависимости от количества усвоенного крахмала и ингибируется при наличии глюкозы в среде, то есть ЦГТаза является индуцибельным ферментом (Nishida et al., 1997; Nishida et al., 1999).
Кроме того, специфическая ферментативная активность сравнительно низка в течение логарифмической фазы роста культуры, но резко возрастает в стационарной фазе, когда рост культуры и потребление ею крахмала прекращаются. Исходя из консерватизма каталитических свойств циклодекстрин глюканотрансферазы, можно предположить, что продукты реакции играют существенную роль в жизнедеятельности циклодекстриногенных штаммов. Поэтому считается, что ЦГТаза имеет как правило внутриклеточную локализацию, а образование внеклеточного фермента связано со спорообразованием (Усанов и др., 1990). Нарушение этого процесса связывают с отсутствием ЦГТазы у некоторых штаммов. Анализ полученных экспериментальных данных свидетельствует о наличии коррелятивной связи образования ЦД с функцией спорообразования. В данном случае имеется закономерность ферментативной реакции конденсационного типа, выражающаяся формулой Kcond=l/Khydr и обусловленная обратно пропорциональными условиями гидролитической реакции. Ведущими условиями осуществления реакции конденсации являются высокая концентрация субстрата при минимальном содержании воды. При споруляции в результате образования спор отмечается резкое уменьшение содержания свободной воды в связи с переходом ее в связанную форму, что обуславливает перевод ферментативной активности клетки из гидролитической в конденсационную. При изменении клеточной дифференциации, когда обезвоженная спора, попадая во влажную среду, начинает прорастать, наступает переход ферментативной реакции из конденсационной в гидролитическую, в данном случае вместо синтеза ЦД происходит их гидролиз. Этот уникальный метаболический путь выгоден для микроорганизмов, образование ЦД соединений не является «тратой» источников углерода, а как раз наоборот, является выгодным метаболическим путем для микроорганизма. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что система экстрацеллюлярного синтеза, их специфического распознавания, трансмембранного транспорта и внутриклеточной деградации циклодекстринов эффективна и синхронизирована (Hashimoto et al., 2001).
Биохимические методы
Бактериальный рост в процессе культивирования оценивали по оптической плотности культуральной жидкости на спектрофотометре при 600 нм в кювете шириной 1 см. В качестве контроля использовали соответствующую жидкую питательную среду, не инокулированную тестируемыми штаммами. 2.3.2. Определение циклодекстрин глюканотрансферазной активности Тест на ЦГТазную активность проводили по методу Тильдена-Хадсона с некоторыми модификациями (Tilden, Hudson, 1942). Циклодекстриногенный штамм наращивали 1-3 суток на жидкой среде КА, КА cgt (с добавлением СаСОз), либо на твердой КА 1 с помощью пялец (рН 7.5 - 7.7). В случае использования твердой фазы целлофан, предварительно прокипяченный в 1% глицерине в течение 40 мин и закрепленный на пяльцах, помещали в чашку Петри, в углубление заливали КА 1 среду, а на обратную сторону целлофана наносили колонию ЦГТазного штамма. Через 2-3 суток биомассу суспендировали в натрий-ацетатном буфере (0.1 М CH3COONa, рН 5.9) и центрифугировали. Бесклеточный супернатант ночной культуры инкубировали в буфере (0.1 М CH3COONa, 3% крахмал, рН 5.9) в отношении 1:1 и 1:2 при 40С. Окрашенную йодом реакционную смесь оценивали под микроскопом через 40 минут. Начало реакции характеризовалось голубовато-фиолетовым окрашиванием, конец -коричневато-золотистой окраской препарата, в котором обнаруживались кристаллы комплекса ЦД и йода. 2.4. Молекулярно-биологические методы исследований 2.4.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989). Колонией E.coli, несущей плазмиду, засевали 100 мл среды LB со 100 мкг/мл ампициллина и выращивали при 37С при постоянном встряхивании в течение 16 часов. Затем клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин в центрифуге К-23. Осадок суспендировали в 2 мл ТЕ-буфера (10 мМ Трис НС1, рН 8.0 и 5 мМ ЭДТА) с сахарозой (50 мМ). Лизис проводили раствором щелочи (0.2 М NaOH, 1% SDS). Осторожно перемешивали в течение 5 мин, пока раствор не становился вязким и прозрачным. Затем добавляли нейтрализующий раствор (4 М СН3СООК, рН 4.8). Полученный лизат осветляли в центрифуге К-24 в течение 10 мин при 10000 об/мин. Осторожно отбирали супернатант и добавляли к нему 1/5 объема 5 М NaCl и 2 объема 96% этанола. Замораживали при -70С в течение 1 часа, при этом формировался осадок плазмидной ДНК. Растворяли полученный осадок в 100 мкл НгО. Депротеинизацию проводили, перенося раствор в эппендорф и прибавляя равный объем смеси фенол:хлороформ.
Встряхивали в течение 3 минут и центрифугировали на микроцентрифуге MPW 50, отбирали верхнюю водную фазу, не задевая интерфазы, содержащей белки. К отобранной фракции добавляли 1 объем хлороформа и повторно центрифугировали. Водную фазу, содержащую плазмидную ДНК, осаждали двумя объемами спирта в присутствии 0.3 М ацетата натрия. Качество выделенных ДНК проверяли электрофорезом в агарозном геле. 2.4.2. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле Электрофорез проводили в приборах подводного типа GNA-200 (Pharmacia, Швеция) или аналогичных приборах, изготовленных в инструментальной мастерской Уфимского научного центра РАН. Источниками питания служили приборы фирмы Bio-Rad модели 1420В или 250/2.5 (США). В зависимости от размера разделяемых фрагментов использовали 0.8 - 1.2%-ные гели на основе агарозы в трис-ацетатном буфере, рН 7.8. В качестве маркеров использовали фрагменты ДНК фага А, после расщепления рестриктазой BstElI, Есо9П либо PspEI. После окончания электрофореза гели окрашивали бромистым этидием (1 мкг/мл) в течение 20 мин. Одноцепочечную форму ДНК фагмид окрашивали акридиновым оранжевым (30 мкг/мл) в течение 20 мин, затем отмывали водопроводной водой в течение 10 мин. Флуоресценцию нуклеиновых кислот наблюдали в ультрафиолетовом трансиллюминаторе ТМ-36 (UV Products, Inc., США). Гели визуализировали и фотографировали на трансиллюминаторе UVT1 (фирма Biocom). Для разделения фрагментов тотальных ДНК мы проводили электрофорез в 6% полиакриламидном геле (ПААГ) в 1 X ТВЕ буфере (Трис НС1, борная кислота, 10 мМ ЭДТА, рН 8) при напряжении 180 V согласно (Sambrook et al., 1989). 2.4.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля Экстракцию фрагментов ДНК из агарозы проводили по методу электроэлюции (Sambrook et al., 1989). Гель с разделенными фрагментами ДНК окрашивали бромистым этидием, локализовали нужный фрагмент, вырезали его скальпелем и помещали в диализный мешочек, заполненный буфером (0.5 X ТАЕ). Элюцию проводили 30 мин в приборе для электрофореза при постоянном перемешивании буфера (0.5 X ТАЕ) магнитной мешалкой. По окончании электрофореза на 15 сек меняли направление тока для того, чтобы ДНК со стенок мешочка перешла в раствор. Затем сливали содержимое мешочка в чистую пробирку, мешочек промывали небольшим количеством 0.5 X ТАЕ и сливали в ту же пробирку остатки ДНК. Измеряли объем элюата и проводили очистку ДНК на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. 2.4.5. Очистка ДНК хроматографией с ДЭАЭ-целлюлозой Хроматографическую очистку ДНК проводили по методу, описанному Манниатисом и др. (1984). Микроколонку заполняли взвесью ДЭАЭ-целлюлозы объемом до 0.2 см3. Последовательно промывали колонку буферами следующих составов: 3 мл (ТЕ рН 7.6, 1 М NaCl); 3 мл (ТЕ рН 7.6, 0,1 М NaCl). Наносили на колонку раствор элюированной ДНК, добавив к нему NaCl до 0.1 М. При этом ДНК сорбировалась на ДЭАЭ-целлюлозе. Промывали колонку 3 мл буфера (ТЕ рН 7.6, 0.1 М NaCl). Далее извлекали ДНК в эппендорф 3 раза по 150 мкл буфером (ТЕ рН 7.6, 1 М NaCl) и осаждали очищенный элюат двойным объемом этанола. 2.4.6. Расщепление ДНК рестриктазами Расщепление ДНК рестриктазами проводили в буферах, рекомендованых фирмами-поставщиками для каждой рестриктазы. Время рестрикции варьировало от 1-го часа до 1-х суток в зависимости от цели эксперимента и количества препарата ДНК. Температура инкубации составляла 37С. Полноту и качество рестрикции проверяли на аналитическом электрофорезе в агарозном геле. Аналитическую рестрикцию проводили в 20 мкл, препаративную - в 50-100 мкл. 2.4.7, Выделение векторной ДНК «медленным» способом Центрифугировали ночную культуру E.coli, несущую нужную плазмиду, 3000 об/мин в течение 15 мин.
Осадок доводили до гомогенного состояния охлажденным во льду буфером (10% сахароза, 50 мМ Трис НС1, рН 8). К полученной суспензии добавляли свежий раствор лизоцима 6 мг/мл в 0.25 М Трис НС1, рН 8, осторожно перемешивали и инкубировали при 4С. После часовой инкубации к суспензии добавляли 0.5 М ЭДТА и выдерживали при 0С 10 мин. Затем после добавления смеси детергентов (0.4% дезоксихолат натрия, 2% бридж), когда раствор становился прозрачным, суспензию разделяли на ультрацентрифуге (Spinco L2 65В, фирма Beckman) при 30000 об/мин в течение 30 мин. К супернатанту приливали 5 М NaCl и ПЭГ 6000 40%, перемешивали и оставляли на 14 часов при О С. ДІЖ осаждали центрифугированием 15 мин 3000 об/мин и растворяли в дистиллированной воде. К полученному раствору добавляли SDS до 0.2% и 0.1 М NaCl. Экстракцию ДНК проводили эквивалентной смесью фенол:хлороформ, затем только хлороформом (1:1). Водную фазу осаждали тремя объемами 96% этилового спирта в течение 14 часов при -20С. Осадок собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, промывали 70% этиловым спиртом, подсушивали и растворяли в дистиллированной воде или ТЕ буфере. 2.4.8. Лигирование фрагментов ДНК с векторной ДНК Фрагменты ДНК, расщепленные рестриктазами, «сшивали» между собой при помощи фермента ДНК-лигазы фага Т4 в 10 х лигазном буфере (0.66 М Трис НС1, рН 7.6, 50 мМ MgCl2, 50 мМ ДТТ, 10 мМ АТФ). Общий объем раствора, содержащий векторную ДНК и чужеродную ДНК, составлял 20 мкл. В раствор добавляли 0.05 ед/мкл ДНК-лигазы. Лигирование проводили при 4-8С в течение 16 часов. 2.4.9. Подготовка компетентных клеток Вносили 1 мл ночной культуры E.coli штамма XL 1-Blue в колбу на 200 мл со 100 мл LB среды, содержащей тетрациклин (15 мкг/мл), и наращивали клетки до OD55o=0.3 при 37С при интенсивной аэрации. Затем клетки собирали центрифугированием на центрифуге К-23 при 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант удаляли и осторожно суспендировали клетки в 25 мл охлажденного до 4С буфера I (10 мМ СаС12, 50 мМ МпС12, 100 мМ КС1, 30 мМ СНзСООК, рН 5.8). Повторно проводили центрифугирование при 2500 об/мин, 10 мин. Удаляли супернатант как можно более полно и также мягко суспендировали клетки "в 5 мл охлажденного до 4С буфера II (75 мМ СаСЬ, 10 мМ КС1, 15% глицерин, 10 мМ MOPS, рН 6.5).
Скрининг и отбор штаммов для геномного шаффлинга
Помимо ДНК шаффлинга заметное внимание в нашей работе было уделено геномному шаффлингу. В 2002 г. появился этот новый метод ускоренной направленной эволюции, позволяющий увеличивать генетическое разнообразие внутри отобранных популяций бактерий при помощи рекомбинации между индивидуальными микроорганизмами (Zhang et al., 2002; Stephanopoulus, 2002; Patnaik et al., 2002). Метод геномного шаффлинга как бы имитирует происходящий в природе с относительно низкой частотой (в отличие от плазмидной трансформации) спонтанный обмен генетическим (хромосомным) материалом между бактериями, приводящий к появлению у таких штаммов новых фенотипических признаков. В лабораторных условиях обмен генетическим материалом между бактериями, лишенными клеточной стенки, производится путем слияния их протопластов в присутствии полиэтиленгликоля. При этом оба микроорганизма должны иметь специфические маркерные признаки, благодаря которым можно отбирать только те колонии, которые образовались в результате слияния протопластов и произошедшего обмена генетической информацией. С этой целью нами был проведен скрининг большого числа бациллярных алкалофильных штаммов. В качестве природных источников новых рН-толерантных бактериальных изолятов использовали отдельные пробы почвы, отобранные в парковых зонах г. Уфы. Для получения чистых линий (отдельных колоний микроорганизмов) использовали стандартный метод физического разобщения путем высева почвенной суспензии на агаризованную среду. Нами было отобрано 10 образцов почвы, из которых в дальнейшем высевом на среду КА S (рН 6.8) было выделено 25 чистых культур аэробных спорообразующих бактерий, и проверена их морфология по методологии, описанной в главе Объекты и методы исследований. Среди 22 штаммов был проведен скрининг строгих алкалофилов.
По результатам проверки способности штаммов к росту и потреблению крахмала на среде КА S (рН 10, рН 7) в качестве реципиента генетического материала был отобран штамм-алкалофил Bacillus species 12, не способный к деструкции крахмала, показывающий рост при рН 10, и не проявляющий такового при рН 7. В качестве донора генетического материала, подходящего по комплементации маркерных признаков, был выбран ЦГТазный штамм Bacillus species 1069 на основе его неспособности расти, а тем более проявлять крахмалгидроглизующую активность на среде КА S (рН 9, рН 10). 3.3. Проведение геномного шаффлинга между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 12 и ЦГТазным штаммом Bacillus sp. 1069 С целью проведения геномного шаффлинга между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 12 и ЦГТазным штаммом Bacillus sp. 1069 было осуществлено слияние их протопластов (полученных ферментативным воздействием лизоцима в концентрации 500 мкг/мл на клеточные стенки), взятых в соотношении 1:1, и их регенерация как описано в главе Объекты и методы исследований. В качестве стабилизатора осмотического давления была выбрана 1 М сахароза, которая кроме осуществления стабилизирующего воздействия на протопласты также положительно влияет на их реверсию (Яковенко, 1985). Для выявления рекомбинантного потомства рассев обработанных ПЭГ протопластов проводили на полную изотоническую среду DMP, что способствовало появлению колоний обоих родителей и рекомбинантов. Это так называемая непрямая селекция, при прямой селекции засев проводят сразу на селективные среды. Для отбора рекомбинантов был использован классический метод реплик выросших на полной изотонической среде клонов на селективную среду КА S (рН 10) при помощи стерильных нитроцеллюлозных фильтров. К сожалению, обнаруженные клоны, обладающие крахмалгидролизирующей активностью, не показывали таковой активности при повторном пересеве. При этом следует отметить, что в опытах по получению межвидовых гибридов путем слияния протопластов первичные гибридные колонии после одного-двух пересевов часто расщепляются на клоны с родительскими генотипами (Яковенко, 1985). Скорее всего, полученные первичные гибриды представляли собой нестабильные гетерогеноты, наследующие обе родительские хромосомы. В полученной структуре родительские геномы могут взаимодействовать путем рекомбинации; когда рекомбинация не происходит и фенотип определяется комплементационным взаимодействием родительских геномов, наблюдается сегрегация родительских форм и иногда длительное (до нескольких месяцев) сосуществование диплоидных. Причем диплоиды, полученные в результате внутривидового слияния протопластов, часто показывают фенотип только одного родителя (Hotchkiss, Gabor, 1980). Также можно было наблюдать появление нескольких рекомбинантных генотипов в одной колонии, являющихся результатом сегрегации нескольких или одной из родительских аллелей. Комплементарные генотипы, родительские или рекомбинантные не появляются в виде одной колонии. Постулировано, что полные геномы смешанных протопластов часто становятся фрагментированными, и этот процесс кроссинговера часто повторяется между фрагментами до получения гаплоидных рекомбинантов (Hoopwood et al., 1978). В нашем повторном эксперименте отбор рекомбинантных клонов проводили методом прямой селекции: был осуществлен засев суспензии протопластов сразу в жидкую селективную среду с рН 10. Однако в результате не было получено ни одной колонии. Это можно объяснить тем, что жидкая селективная среда не содержала никаких стабилизаторов, источников Mg для реверсии протопластов к клеточным формам и имела высокие значения рН (рН 10); кроме того, необходимым условием для регенерации является наличие в ревертирующей системе твердой или полутвердой физической основы: желатина, 0.7-2% агара, остатки клеточной стенки, убитые бактерии и так далее. Таким образом, для регенерации клеточной стенки бацилл, использованных в нашем эксперименте, была необходима полная изотоническая твердая среда с нейтральными значениями рН. Считается, что обмен генетической информацией при слиянии протопластов происходит по типу гомологичной рекомбинации, и ее частота значительно уменьшается в зависимости от степени родства между донором и акцептором. Следовательно, можно предположить, что уровень нуклеотидной гомологии между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 12 и циклодекстриногенным штаммом Bacillus sp. 1069 не позволил нам добиться такого обмена. 3.4.
Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 1 Можно считать, что ДНК/геномный шаффлинг является модификацией геномного шаффлинга и заключается в трансформации протопластов микроорганизма-реципиента тотальной ДНК микроорганизма-донора генетического материала в присутствии все того же полиэтиленгликоля. С учетом того, что способность к деструкции крахмала и алкалофильность являются удобными маркерными признаками, нами был проведен первоначальный скрининг большого числа бациллярных алкалофильных штаммов среди отобранных образцов почвы и выделены подходящие чистые культуры бацилл, не обладающие способностью к росту и потреблению крахмала на твердой среде при рН 7. По результатам дальнейшей проверки способности отобранных штаммов расти на жидкой среде с 0.2-1% глюкозы (рН 10) в качестве единственного источника углерода нами был отобран бациллярный алкалофильный штамм-акцептор генетического материала (культура № 4 на рис. 3.4), способный нарабатывать биомассу на среде с глюкозой в 10 раз эффективнее, чем на среде с 0.2-1% (3-ЦД (рис. 3.5). ДНК/геномный шаффлинг можно рассматривать как имитацию происходящей в природе естественной трансформации, когда тотальная ДНК, вышедшая из умерших клеток почвенных бактерий, может быть «захвачена» другими микроорганизмами. Однако такая трансформация является сложным процессом, состоящим из этапов связывания ДНК (прикрепления к клеточной мембране), переноса ее внутрь клетки и рекомбинации (Ando et al., 1999), причем этому процессу подвержены, прежде всего, бактерии, обладающие естественной компетентностью. При этом хочется отметить, что существует лишь несколько описанных в литературе случаев межвидовой естественной трансформации среди почвенных изолятов, в результате которой происходит перенос хромосомных генов (Nielsen et al., 2000а). Исследования по межвидовой рекомбинации показали, что данный способ горизонтального однонаправленного переноса генетического материала не приносит много «пользы» для микроорганизма-акцептора.
Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 2
В качестве источника генетического материала для проведения ДНК/геномного шаффлинга по схеме 2 был выбран галоалкалофильный штамм-денитрификатор Bacillus nitritophilus IB-256 (номер последовательности 16S рРНК в NCBI AJ309562), хорошо развивающийся на средах с 4-7% NaCl, рН 9-9.5 (Гильванова, 2003). Данная культура была выделена из выщелоченного чернозема (пос. Николаевка, Уфимский р-н, Республика Башкортостан), а проведенный филогенетический анализ по результатам секвенирования гена 16S рРНК определил ее положение в кластере, объединяющем несколько недавно описанных галотолерантных родов: Gracibacillus, Halobacillus, Virgibacillus, Lentibacillus и Oceanobacillus (Гильванова, 2003). Наибольшее сходство последовательностей гена 16S рРНК данный штамм обнаруживал с последовательностями того же гена у Virgibacillus marismortui и Bacillus halodenitrificans на уровне 97% и 96% соответственно. Бациллярная культура была представлена палочками среднего размера с терминальным характером расположения спор (рис. 3.10). Тотальная ДНК этого микроорганизма, выращенного аэробно на среде GA (рН 9.5), выделенная по методике, показанной для бацилл (Wilson, 1994), была взята в качестве донорного материала для последующего ДНК/геномного шаффлинга. Очищенная от белков ДНК этого штамма также как и в случае ДНК/геномного шаффлинга по схеме 1 никак специально не фрагментировалась и имела размер в среднем от 30 до 50 т.п.н. При помощи теста на способность расти в анаэробных условиях на селективной среде LB с добавлением N03" при рН 7.5 (то есть на среде, содержащей аминокислотные компоненты и нитрат натрия) было проанализировано свыше 20 а- и (3- специфичных ЦГТазных штаммов. Анализ проводили в двух повторностях, каждый по 7-10 дней. Инкубирование осуществляли в анаэробных пробирках, полностью заполненных средой и герметично закрытых завинчивающими крышками, не пропускающими кислород. В результате первоначального скрининга было отобрано 7 ЦГТазных штаммов, не способных к нитратному дыханию. После повторной проверки нами был уже отобран единственный наиболее подходящий акцептор генетического материала - штамм Paenibacillus species 839 (рис. 3.12), не показывающий роста на тестовой среде и, соответственно, не обладающий нитратредуктазной активностью. ДНК/геномный шаффлинг проводили посредством трансформации протопластов клеток реципиента - ЦГТазного штамма Paenibacillus sp. 839 тотальной ДНК галоалкалофильного штамма Bacillus nitritophilus IB-256 аналогично первому эксперименту. Состав питательных, накопительных, селективных сред и буферов был модифицирован таким образом, чтобы в них не было углеводных источников.
Это позволило исключить возможность ошибочно принять рост в анаэробных условиях, который может возникнуть в результате переключения бактерий с дыхательного метаболизма на бродильный, за приобретенную способность к денитрификации или нитратному дыханию. В ходе ДНК/геномного шаффлинга произошла трансформация протопластов клеток реципиента - ЦГТазного штамма Paenibacillus sp. 839 тотальной ДНК галоалкалофильного штамма Bacillus nitritophilus IB-256. Смесь протопластов была анаэробно инкубирована в накопительной жидкой среде с нитратом NS (рН 7.9). На следующие сутки уже был заметен рост в нижней и средней части анаэробного сосуда, который через двое суток наблюдался во всем объеме, тогда же был сделан первый пассаж: 100 мкл полученной взвеси высевалось на среду КА1 (рН 7.7). Так были получены первичные трансформанты и среди них был проведен клональный анализ. Из 100 мкл суспензии выросло 26 колоний, обладающих крахмалгидролизующей активностью: 3 из них имели родительский морфотип S - выпуклые слизистые колонии, 23 - рекомбинантный, R. Из последних: 14 колоний образовывали шероховатые колонии с неровными краями, а 9 имели схожую колониальную морфологию, но их особенностью можно считать частичное врастание колоний в среду. Среди полученных первичных рекомбинантов для дальнейших пассажей в жидкой среде с нитратом были отобраны по одной колонии типов S (839 1) и R (839 6) (рис. 3.13). Через 3-е суток были осуществлены первые анаэробные пассажи бактериальной суспензии из верхней части сосуда в жидкую среду с 0.2% и 0.5%) NaN03 (рН 7.8). При этом лучший рост в анаэробных пробирках наблюдался на среде с 0.5% нитрата. В процессе пассажирования проводили высев рекомбинантов на среду с крахмалом (рН 7.5-7.8). Единичными колониями вторичных трансформантов инокулировали среду с нитратом и/или нитритом (рис. 3.14). Из анаэробной культуры делали высев на твердые среды. В среднем было совершено 5 пассажей на жидких средах. Спустя 6 суток из исходного анаэробного сосуда был сделан высев на твердую среду с крахмалом КА1 (рН 7.5) так называемых «поздних» трансформантов. Морфологический анализ выросших колоний позволил идентифицировать их как колонии типа R. Полученные колонии были однородными, чистыми; колонии других типов отсутствовали. Единичные клоны были отобраны для проведения дальнейших тестов. Полученные «поздние» трансформанты показывали очень высокую скорость роста как в жидких средах с нитратом и нитритом натрия в анаэробных условиях, так и на твердых средах, содержащих крахмал. При этом их рост сопровождался интенсивным потреблением крахмала (рис. 3.15). Анализ всех полученных колоний показал, что клоны, имеющие морфотип родительского штамма, то есть так называемый вариант S, проявляют невысокую стабильность при пересевах.
Клоны, имеющие рекомбинантный морфотип R, достаточно стабильны и сильно отличаются по своим физиолого-биохимическим характеристикам, как от родительского штамма, так и от других полученных трансформантов (табл. 3.1). Обобщая данную часть работы, можно заключить, что в результате ДНК/геномного шаффлинга произошел перенос генетического материала от донора алкалофильной денитрифицирующей культуры Bacillus nitritophilus IB-256 к циклодектриногенному акцептору Paenibacillus sp. 839, что выразилось в приобретении потомством способности расти в анаэробных условиях в присутствии NaN03 в концентрации 0.2-1% (нитратное дыхание). Причем, некоторые штаммы активно восстанавливали и NaN02 в концентрации 0.2-0.5%, а также приобрели способность расти в щелочной области рН (рН 9-9.5) на среде с 5-7% содержанием NaCl, то есть в результате эксперимента была повышена гало- и рН-толерантность штамма-акцептора генетического материала. Одновременно наблюдалось сохранение циклодектрин глюканотрансферазной активности у химерных штаммов (рис. 3.16) (ЦГТазную активность проверяли по методике Тильдена-Хадсона как описано в главе Объекты и методы исследования). На заключительном этапе ДНК/геномного шаффлинга были созданы селективные условия, в которых из суспензии регенерировавших протопластов родительского штамма могли дать рост лишь те трансформанты, которые приобрели необходимые для выживания в данной среде свойства. Это позволило уже на первых этапах скрининга работать с рекомбинантами. Возможность возникновения среди потомства трансформированных клеток штамма-акцептора генетического материала сводилась к минимуму благодаря тому, что на этапе первоначального скрининга была подтверждена неспособность родительского ЦГТазного штамма к анаэробному росту на нитратсодержащей среде. Помещение регенерировавших протопластов в накопительную среду с нитратом в анаэробных условиях было своего рода «шоком» для аэробных бактерий: трансформация в неблагоприятных условиях роста сдвигает баланс в сторону селекции межвидовых трансформантов (Majewski, Cohen, 1999).